基于泛素蛋白酶体途径研究牵正散合大补阴丸对体外帕金森模型的影响
发布时间：2020-07-23 11:31
【摘要】：目的:用蛋白酶体抑制剂(Proteasome inhibitor,PSI)诱导PC12细胞,建立体外大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocy-toma cells,PC12)帕金森病模型,以细胞增殖周期、凋亡、SOD活性和MDA水平以及泛素蛋白酶体途径为研究切入点,探讨牵正散合大补阴丸对细胞增殖周期、凋亡、SOD活性和MDA水平以及泛素蛋白酶体途径中相关因子TBP1-19、PA28α在蛋白表达水平的影响,从细胞和分子水平上明确牵正散合大补阴丸对PC12细胞的影响,从而确定牵正散合大补阴丸对帕金森(颤证)的作用。方法:利用MTT法检测牵正散水煎剂及大补阴丸水煎剂对PC12细胞的细胞毒性作用;采用DAPI染色及伊红染色相结合的方法,利用倒置荧光显微镜观察确定PSI诱导PC12细胞形成的帕金森病细胞模型的合适剂量;利用HE染色观察PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型的嗜酸性小体;利用MTT法确定牵正散水煎剂及大补阴丸水煎剂对PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型增殖的影响;采用流式细胞术检测牵正散合大补阴丸水煎剂干预48h时PSI诱导的PC12细胞模型周期变化情况以及细胞死亡情况;Annexin V/FITC流式细胞分析法检测细胞凋亡率;采用SOD、MDA检测法测定牵正散合大补阴丸水煎剂干预48h对PSI诱导的PC12细胞模型的细胞内SOD值与MDA值的影响;利用Western Blot技术测定牵正散合大补阴丸水煎剂在有无PSI诱导时时对细胞内相关因子TBP1-19、PA28α蛋白表达的影响。结果:MTT结果显示,不同浓度的牵正散、大补阴丸对细胞增殖有不同的影响:作用细胞48h时,牵正散水煎剂从6 mg/ml浓度开始显示出对细胞增殖的抑制作用,12及24mg/ml浓度的抑制率分别为61%及91%;大补阴丸水煎剂从0.125mg/ml浓度开始显示出对细胞增殖的抑制作用,0.25、0.5、1及2mg/ml浓度的抑制率分别为14%、9.8%、0.64%及26.46%;不同浓度的牵正散水煎剂及大补阴丸水煎剂均可改善PSI对PC12细胞增殖的抑制作用。用SPSS Statistics 20软件计算出药物相应IC0、IC25及IC50,牵正散水煎剂对大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞作用48h的ICO为0.2 mg/ml、IC25为12.292 mg/ml、IC50为22.652 mg/ml,大补阴丸水煎剂对大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞作用48h的IC0为0.814mg/ml、IC25为4.485mg/ml、IC50为9.004mg/ml;体外MTT法实验结果显示,12.292mg/ml(IC25)浓度的牵正散水煎剂与4.485mg/ml(IC25)浓度的大补阴丸水煎剂表现出的缓解PSI诱导的PC12细胞模型损伤较为显著。DAPI及伊红染色显示PSI在浓度为6μmol/L时,PC12细胞的形态改变及胞浆中嗜酸性小体表现最为典型;HE染色后,倒置显微镜下观察结果显示PSI作用下PC12形态及数量均发生改变。流式细胞术周期结果显示,PSI诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞会影响细胞周期,但牵正散合大补阴丸未见明显改善细胞周期。Annexin V/FITC流式细胞分析法凋亡结果显示,PSI组细胞凋亡率升高,加药组不同程度降低凋亡率。SOD及MDA含量检测结果显示,PSI组与空白对照组相比大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12的SOD活力值下降,脂质过氧化产物MDA含量升高;加药处理后,各剂量组牵正散水煎剂与大补阴丸水煎剂与PSI组相比SOD活力升高、MDA含量下降。Western Blot结果显示,PSI诱导PC12细胞后,可增加TBP1-19、PA28α的蛋白表达量。加药处理后,与PSI组相比,各剂量组牵正散水煎剂可降低TBP1-19、PA28α蛋白表达量;各剂量组大补阴丸水煎剂能降低TBP1-19、PA28α蛋白的表达量。结论:PSI诱导的PC12体外帕金森模型具有科学意义;牵正散水煎剂、大补阴丸水煎剂及合方均可缓解PSI对PC12体外帕金森模型的抑制作用,可提高PSI诱导的PC12细胞存活率;其机制为调控PSI诱导的PC12细胞凋亡及细胞内SOD、MDA含量,此外,通过调节泛素蛋白酶体途径中相关因子TBP1-19、PA28α蛋白水平的表达来影响机体的代谢,从而发挥缓解帕金森(颤证)作用。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：
诱导ＰＣ１２细胞凋亡具有神经保护作用。越来越多的证据表明，ＵＰＰ的紊乱可能导致许多疾逡逑病，如恶性肿瘤、神经退行性疾病和可能的系统性自身免疫。逡逑上述信号通路对帕金森病作用过程总结如下图１所示。逡逑Ｐ侧ＡＰＫ辟sE一？逦元保逡逑Ｗｎｔ／ｐ－？ｔｅｎ，ｎ（ｇ＾邋￣￣逡逑Ｊ逦减缓帕金森病＾逡逑Ｉ邋逦邋逦邋逦邋ｆ、（邋ＩＫＥ）进程）逡逑Ｍｒ＞ｒ，邋Ｍ邋＾逦ｈ激；ＳＥｒｂ邋Ｂ家族的栜逦．增强通路活性．保护逡逑ＮＲＧｌ－ｔｒＤＢ４ｆＳ＾邋逦？促迎媂胞内传导￣？多巴胺神经元逡逑｜减短内质网应激，降逦｜卿线粒体凋亡途径逡逑泛Ｍ白z1体途径邋逦？低通臼酹体的降解．一？的活化，抑制x纪觯哄义希撸咤邋五五五澹蝳蔽诲危哂猩窬被ё饔缅危掊义贤迹保保惨┪锿ü藕磐范耘两鹕∽饔霉体义献凵纤觯疃嘀幸揭┩ü藕磐范耘两鹕〉闹瘟贫加幸欢菩В移渲写蟛糠皱义霞旱玫搅俅彩匝榱菩еС帧Ｅ两鹕〉姆⒉』粕形赐耆徊鳎古两鹕┪镏涞南噱义匣ブ饕频奶剿骰共怀沟住５幸揭┰谥瘟疲校姆矫婢哂泻艽笄绷Γ俅彩笛橹校幸└ㄥ义现瘟票鹊ゴ课饕┲瘟贫裕校幕颊哂懈玫牧菩
本文编号：2767267
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：
诱导ＰＣ１２细胞凋亡具有神经保护作用。越来越多的证据表明，ＵＰＰ的紊乱可能导致许多疾逡逑病，如恶性肿瘤、神经退行性疾病和可能的系统性自身免疫。逡逑上述信号通路对帕金森病作用过程总结如下图１所示。逡逑Ｐ侧ＡＰＫ辟sE一？逦元保逡逑Ｗｎｔ／ｐ－？ｔｅｎ，ｎ（ｇ＾邋￣￣逡逑Ｊ逦减缓帕金森病＾逡逑Ｉ邋逦邋逦邋逦邋ｆ、（邋ＩＫＥ）进程）逡逑Ｍｒ＞ｒ，邋Ｍ邋＾逦ｈ激；ＳＥｒｂ邋Ｂ家族的栜逦．增强通路活性．保护逡逑ＮＲＧｌ－ｔｒＤＢ４ｆＳ＾邋逦？促迎媂胞内传导￣？多巴胺神经元逡逑｜减短内质网应激，降逦｜卿线粒体凋亡途径逡逑泛Ｍ白z1体途径邋逦？低通臼酹体的降解．一？的活化，抑制x纪觯哄义希撸咤邋五五五澹蝳蔽诲危哂猩窬被ё饔缅危掊义贤迹保保惨┪锿ü藕磐范耘两鹕∽饔霉体义献凵纤觯疃嘀幸揭┩ü藕磐范耘两鹕〉闹瘟贫加幸欢菩В移渲写蟛糠皱义霞旱玫搅俅彩匝榱菩еС帧Ｅ两鹕〉姆⒉』粕形赐耆徊鳎古两鹕┪镏涞南噱义匣ブ饕频奶剿骰共怀沟住５幸揭┰谥瘟疲校姆矫婢哂泻艽笄绷Γ俅彩笛橹校幸└ㄥ义现瘟票鹊ゴ课饕┲瘟贫裕校幕颊哂懈玫牧菩
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