基于网络药理学探讨当归贝母苦参丸治疗前列腺癌的分子机理

发布时间：2020-07-24 06:22

【摘要】：目的:在前列腺癌的综合治疗过程中,中医药的地位日益显著。在本研究中,我们立足于探索当归贝母苦参丸对前列腺癌的治疗机制,通过网络药理学方法分析复方中所包含的成分及其作用靶点,将药物本身的作用靶点与前列腺癌疾病相关的靶点相匹配,寻找当归贝母苦参丸作用于前列腺癌的的主要作用靶点和主要有效成分。随后,选取该复方中主要的成分--槲皮素(Que)进行体外实验验证,证实前期的分析结果的有效性和准确性。方法:通过TCMSP数据平台检索当归贝母苦参丸中所包含的化学成分和作用靶点,通过Uni Prot KB网络平台以及Genecards数据库获取靶蛋白的基因名;使用Cytoscape软件构建当归贝母苦参丸的成分--靶点网络图。通过文献查阅以及查询CTD数据库、TTD数据库的方式来获取前列腺癌疾病相关的靶点,将前列腺癌疾病相关靶点与当归贝母苦参丸作用靶点进行分子对接,在STRING数据库中构建蛋白-蛋白互作网络(PPI),在Cytoscape中进行网络可视化分析。通过DAVID数据平台对关键靶蛋白进行GO分析、KEGG富集通路分析,并对分析的结果进行总结和分类。根据网络药理学分析结果,选取网络中的主要成分Que进行体外细胞学实验进行验证。首先培养前列腺癌PC3细胞,观察加药后不同浓度Que对前列腺癌细胞形态的影响、通过台盼蓝染色计数实验观察Que对前列腺癌细胞增殖的影响、通过Transwell实验观察Que对前列腺癌细胞迁移能力的影响、通过流式细胞仪检测不同浓度Que对前列腺癌细胞凋亡的影响,最后通过Western-blot实验检测加药后不同浓度Que对前列腺癌细胞内与增殖和凋亡相关蛋白的影响。结果:1.网络药理学分析结果(1)从TCMSP中药数据库中筛选出该复方中的有效成分共含有255个,经过OB值和DL值评估后得到26个有效成分,这26个有效成分共有246个作用靶点。(2)采用Cytoscape软件构建当归贝母苦参丸的成分--靶点网络图。网络图表明当归贝母苦参丸中具有代表性的成分节点有槲皮素(MOL000098),木犀草素(MOL000006)等;而前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)、热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP 90)等则是该复方发挥作用的主要靶点。(3)当归贝母苦参丸作用于前列腺癌的靶点共有135个,通过蛋白--蛋白互作网络图分析发现这些靶点之前的相互作用关系多达3066种。通过Cytoscape中的插件和算法分析出这135个靶点中的关键基因有34个。(4)通过GO分析和KEGG富集通路分析总结出当归贝母苦参丸主要能够通过促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭以及抑制肿瘤血管生成来发挥其抗肿瘤作用。2.体外实验验证结果:(1)Que对前列腺癌细胞增殖的影响:在加药24h和48h后,加药组的细胞数量与对照组相比明显减少,并呈药物剂量依赖性(P0.0001)。(2)Que对前列腺癌细胞凋亡的影响:随着药物浓度的不断增高,前列腺癌PC3细胞的凋亡数目不断增多,当浓度为150um时,Que的促凋亡作用最明显,凋亡率为26.13±3.36%。(3)Que对前列腺癌细胞迁移的影响:加药16h后统计穿出Transwell小室的细胞数,发现Que能抑制PC3细胞的迁移能力,并呈药物剂量依赖性(P0.005)。(4)Que对前列腺癌细胞中增殖和凋亡相关蛋白表达的影响:Que能够明显降低PC3细胞内与增殖相关的蛋白p-AKT的表达;此外还降低了抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2的表达、升高了促凋亡蛋白BAX的表达。此外,Que还对分子伴侣蛋白HSP90具有一定的抑制作用。结论:1.经网络药理学分析表明,中药复方当归贝母苦参丸中包含多种有效的抗癌成分,具体可能通过以下四种方式:抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞的迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成。2.实验验证表明,复方中的主要成分Que能够通过抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、促进PC3细胞的凋亡、抑制PC3细胞的迁移来发挥其抑癌作用。该实验验证与前期网络药理学的分析结果部分相吻合。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

HSP 90)、自主神经β2 肾上腺素受体(β-2 adrenergic receptor,ADR构酶Ⅱα(topoisomerase 2α，TOP2α)以及雄激素受体(androgen recep均与前列腺肿瘤的发生发展密切相关，说明这些靶点在当归贝母列腺癌的过程中可能作为主要靶点被抑制来发挥作用。表 1 有效成分基本信息（Degree＞14）MOL ID 成分名称 OB 值（％） MOL000098MOL000006MOL000392MOL000358MOL000449MOL003542MOL000456MOL003673MOL003648MOL006596MOL001484QuercetinLuteolinFormononetinbeta-sitosterolStigmasterol8-Isopentenyl-kaempferolPhaseolinWighteoneInerminGlyceollinInermine46.4336.1669.6736.9143.8338.0478.242.875.1897.2775.18

1.2.2 药物疾病交集靶点的 PPI 网络分析通过前期数据挖掘与分子对接，将获得的药物与疾病交集靶数据库进行分析后，取评分≥0.9 的蛋白互作关系数据导入 Cytosc分析。如图 1.2 所示，该 PPI 网络共有 135 个节点，节点之前的相达 3066 种。通过 CytoHubba 插件中的 Degree、MCC、EPC、D网络中的每个节点进行分析，取每种算法排名前 10 的靶点综合键基因（如图 1.3 所示），分别是 TP53、AKT1、IL6、TNF、MYCIL1B、HSP90AA1、MMP2、JUN、VEGFA、MAPK1、FOS、IL4、IL1A、IFNG、MMP9、、CYP1A1、CASP8、PRKCD、GSK3B、MMP1、BCL2。进一步通过 STRING 对这些关键靶点进行蛋白关度值最高的为 TP53，能与 33 个蛋白相关联，其次还有 JUN 和 P与 32 和 31 个蛋白相关联。所有的关键基因都在前列腺癌的发生演重要角色。

图 1.3 关键靶点网络互作图1.2.3 当归贝母苦参丸治疗前列腺癌的机制分析通过 DAVID 数据分析平台对以上 PPI 网络行 GO 富集分析以及 KEGG 富集分析，研究当能机制。在 GO 分析过程中，我们根据错误发共确定了 350 个条目（FDR＜0.05），其中生物表 2 列出了交集靶基因排名前 20 的生物功能条胞凋亡调控、细胞程序性死亡调控、细胞周期机物刺激反应等方面。在通路富集分析中，共得FDR 值＜0.05 的共有 20 条。如图 1.4 所示，主Pathways in cancer）、前列腺癌信号通路（hsa0号通路（hsa05219：Bladder cancer）、胰腺癌

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本文编号：2768449