补阳还五汤对中风病气虚血瘀证脑缺血大鼠AQP4及相关因子影响研究

发布时间：2020-07-28 10:46

【摘要】：目的:通过补阳还五汤对中风病气虚血瘀证脑缺血大鼠AQP4及咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白5(Claudin-5)蛋白表达的影响,研究中风病气虚血瘀证与AQP4及Occludin、Claudin-5蛋白的关系,探讨中风病气虚血瘀证分子生物学基础与病理机制,为中医药防治缺血性中风病及中风病证候诊断与研究提供参考。方法:选用 SPF(specificpathogenfreeanimals,SPF)级健康雄性SD(spraguedawley,SD)大鼠180只,将大鼠随机分为假手术组,模型组,补阳还五汤组,每组60只。采用控制饲料量造模法结合大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery obstruction,MCAO)法制备气虚血瘀证大鼠脑缺血模型,120 min后拔线栓实施再灌注,造模前三天补阳还五汤组中药灌胃。在3d和5 d两个时间点,观察脑缺血大鼠症状的变化,对各组大鼠的神经功能及气虚血瘀证症状评分;运用干湿重测量法对缺血脑组织的含水量进行测定;运用伊文思蓝(Evansblue,EB)法检测血脑屏障通透性;用透射电镜观察血脑屏障(blood brain barrier,BBB)超微结构的变化;运用Western Blot法检测缺血脑组织中AQP4的蛋白表达及BBB紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-5的表达;运用免疫组化的方法检测缺血脑组织中AQP4蛋白表达情况。结果:(1)各组大鼠在造模前均无神经功能症状表现。在术后1d、3d和5d,与假手术组相比,模型组有明显的神经功能缺损症状,两组比较有极显著性差异(P0.001)。与模型组相比,补阳还五汤组神经功能改善较显著,3d时,两组有显著差异(P0.01),在 1d和 5d两组有差异(P0.05)。(2)各组大鼠在造模后气虚血瘀证症状明显,在3d和5d两个时间点,与假手术组相比,模型组气虚血瘀证表现更加显著,两组之间有显著统计学意义(P0.01)。与模型组相比,补阳还五汤组气虚血瘀证症状明显改善,两组有显著差异(P0.01)。(3)在3d和5 d两个时间点,与假手术组相比,模型组脑组织含水量显著增高,两组比较有显著意义(P0.01);与模型组相比,补阳还五汤组脑组织含水量显著降低,两组比较有统计学意义(P0.05)。(4)在3 d和5 d两个时间点,与假手术组相比,模型组脑组织EB含量显著上升,两组间存在显著意义(P0.01);补阳还五汤组与模型组相比,补阳还五汤组脑组织EB含量显著下降,两组间有统计学差异(P0.05)(5)在3d和5 d两个时间点,假手术组血管内皮细胞间紧密连接形态相对完整,周细胞及星形胶质细胞周围有少量空泡;模型组血管内皮细胞间紧密连接形态损害严重,周细胞及星形胶质细胞周围空泡变性;与模型组相比,阳还五汤组血管内皮细胞间紧密连接缝隙变宽,有断续,形态相对完整,周细胞及星形胶质细胞周围有空泡。(6)在3 d和5 d两个时间点,与假手术组相比,模型组脑组织紧密连接Occludin、Claudin-5的蛋白表达水平下降,脑组织中AQP4的蛋白表达水平上升,两组间存在显著统计学意义(P0.01);与模型组相比,补阳还五汤组脑组织紧密连接Occludin、Claudin-5的蛋白表达水平上升,脑组织中AQP4的蛋白表达水平下降,两组之间统计有差异(P0.05)。(7)脑组织中AQP4蛋白表达以棕黄色为阳性表达,主要分布在星形胶质细胞,以胞膜为主。在3d和5d两个时间点,与假手术组相比,模型组脑组织中AQP4表达显著上升,两组间存在显著统计学意义(P0.01);与模型组相比,补阳还五汤组缺血脑组织中AQP4表达下降,两组间有统计学意义(P0.05)。结论:造模后大鼠有明显神经功能缺损及气虚血瘀症状,提示中风病气虚血瘀证动物模型制备成功。补阳还五汤能够明显改善大鼠神经功能缺损及气虚血瘀症状,提示补阳还五汤对缺血性中风病气虚血瘀证治疗有效。补阳还五汤可能是通过下调脑组织中AQP4的表达,上调脑组织中Occludin、Claudin-5的表达来降低BBB通透性,从而降低脑组织的含水量,以致减轻脑水肿起到脑保护的作用。脑组织中AQP4、Occludin、Claudin-5蛋白表达异常可能是中风病气虚血瘀证形成的重要机制。
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

图１标准品的曲线逡逑屏障超微结构逡逑间点，称重，腹腔麻醉（方法同上），麻醉后术剪剪开腹部皮肤，剖开腹腔，用无菌棉签采血针采取动脉血约４邋ｍｌ，止血钳阻断腹主，取无头针自心尖刺入肺动脉，用动脉夹固生理盐水２００邋ｍｌ冲洗至右心耳流出清盐缓冲液配制的２．５0／0戊二醛溶液２００１１１１固事先预冷的容器上，取缺血侧顶叶皮质１Ｘ１入２．５％戊二醛溶液（电镜专用）中固定，在４后，再用０．１ｍｏｌ／Ｌ邋（ｐＨ７．４）邋ＰＢＳ漂洗４次，

补阳还五汤对中风病气虚血瘀证脑缺血大鼠ＡＱＰ４及相关因子影响研究逦逡逑２）标准品稀释：用ＰＢＳ将１０ＵＬＢＳＡ稀释至１００ＵＬ，按０、２、４、６、８、１２、逡逑邋ＵＬ加入到９６孔板内；蛋白标准品，２邋ｙＬ／？Ｌ；其中３个复孔，不足２０邋ＷＬ，均逡逑补足。逡逑３）加工作液：将配制好的工作液加入孔中，２００邋ＵＬ／孔，３７邋°Ｃ孵育３０邋ｍｉｎ．逡逑４）测吸光度：将酶标仪调至５６２邋ｎｍ处测吸光值（Ａ值）。逡逑５）计算蛋白浓度：根据蛋白标准品的标准曲线（见下图２），计算蛋白浓度。逡逑

ｄｕｄｉａｎ－５逡逑ＡＱＰ４逡逑图１邋ＷＢ测定脑组织中Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、ＡＱＰ４的蛋白表达情况逡逑ｒ删壚、逡逑图２邋３邋ｄ假手术组血脑屏障超微结构５００００Ｘ逦图３邋３邋ｄ模型组血脑屏障超微结构５００００Ｘ逡逑

【参考文献】

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本文编号：2772772