五苓散同方汤剂关键缺失成分入血吸收研究及其抗脑水肿活性评价

发布时间：2020-07-28 10:58

【摘要】：目的:初步验证“五苓方以散不宜汤的作用机制是由于水对低极性成分提取能力有限而导致五苓汤存在多种低极性化合物分子损失”假说,进而阐明五苓方宜散不宜汤的作用机制,为临床剂型选择提供科学的参考依据。方法:①以高效液相色谱法考察江西泽泻、四川泽泻,福建桂枝、广西桂枝、广东桂枝,浙江白术、湖南白术、安徽白术,云南猪苓、陕西猪苓、河南猪苓及安徽福茯苓、云南茯苓、湖南茯苓共14个产地的药材饮片,分析了 8种指标成分在不同产地药材中的含量;②以MS数据分析技术中Strip工具和QI软件技术分析五苓方汤剂和五苓方散剂的入血成分,进而对五苓方汤的入血缺失成分进行分析;③采用Caco-2细胞模型快速筛选工具,研究五苓汤缺失成分23-乙酰泽泻醇B、桂皮醛、麦角甾醇、茯苓酸和白术内酯Ⅰ五种成分在细胞水平通过小肠黏膜的吸收、代谢及转运信息;④以MTT检测6种药物组合及氧糖剥夺时间对星形胶质细胞本身的损伤作用,以LDH漏出率检测各组给药处理对氧糖剥夺的细胞毒作用,采用Western Blot法检测星形胶质细胞AQP4蛋白的表达情况;⑤采用神经功能评分法检测五苓汤缺失成分组合CAE对MCAO大鼠的脑缺血面积及神经功能的改善情况,采用干湿重法测定脑组织左右脑组织中含水量来判断脑水肿的程度,采用Western Blot法检测大鼠脑组织中AQP4、Nrf2和HO-1蛋白相对表达量情况,来检测五苓汤缺失成分组合对水通道蛋白的调节作用及对Nrf-2/HO-1信号通路的作用,利用Luminex技术检测血样中1L-β、1L-6、TNF-α因子表达情况来检测对炎症反应的影响。结果:①不同产地中药泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量差异较大,以四川产地含量最高;对福建、广西、广东三个产地的中药桂枝干燥品有效成分含量测定发现,广东桂枝中桂皮醛和香豆素含量均为最高;白术的道地产地主要在浙江、安徽、及湖南等地,浙江产地白术中白术内酯含量明显高于湖南和安徽产地;湖南茯苓、安徽茯苓、云南茯苓中茯苓酸的含量差异较为明显,含量最高的是云南茯苓;河南、陕西、云南产地中云南猪苓中麦角甾醇含量最高;②对UPLC-MS采集数据进行QI软件分析,筛选出五苓方汤剂完全缺失成分47种,部分缺失成分6种,并对6种五苓方汤散剂共有化合物成分进行了入血吸收含量-时间分布研究。与五苓方散剂相比,五苓方汤剂存在严重的化学成分损失;③经过方法学考察线性关系、精密度、方法回收率和稳定性均在允许误差范围内;吸收转运实验,按难易吸收的判断标准,茯苓酸Papp值均在10-7 cm/s数量级属于难吸收的化合物,桂皮醛Papp值在10-5cm/s数量级属于易吸收化合物,23-乙酰泽泻醇B位于两者之间,属于中等吸收化合物;吸收转运的量效和时效关系,不同时间点取样检测受试化合物桂皮醛的含量发现,AP-→BL和BL→AP的转运率和转运速率随时间延长均呈逐渐增加趋势;④星形胶质细胞氧糖剥夺实验结果显示,根据细胞抑制率及细胞活性状态筛选出最佳复氧时间为6h;最佳给药浓度为桂皮醛、麦角甾醇和23-乙酰泽泻醇B的给药浓度为10 μg/mL,茯苓酸和白术内酯Ⅰ为0.01μg/mL,混合药物浓度为0.1μg/mL;LDH漏出率随药物浓度的增加,呈不断增高趋势。与模型组相比,23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、茯苓酸和混合药组可显著降低LDH漏出率,差异均具有统计学意义(P0.01);与模型组相比而言,桂皮醛组、23-乙酰泽泻醇B、麦角甾醇、茯苓酸、白术内酯Ⅰ和混合药物均可显著降低星形胶质细胞的AQP4蛋白表达量,差异具有统计学意义(P0.01);⑤与MCAO模型组相比,CAE-L组、CAE-M组和CAE-H组均可显著改善MCAO大鼠行为异常和神经功能障碍,具有统计学意义(P0.01);与Sham组相比,MCAO模型组大鼠缺血侧(即IH侧)脑含水量百分比显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);与MCAO模型组相比,CAE-H和CAE-M给药治疗均显著降低MCAO模型组大鼠IH侧脑组织含水量(P0.01/P0.05);与Sham组相比,MCAO模型组大鼠脑组织中AQP4蛋白表达显著增加(P0.01),与MCAO模型组比较,CAE低中高剂量组均可显著下调MCAO大鼠脑组织中AQP4蛋白的表达,差异具有统计学意义(P0.01);与Sham组比较,MCAO模型组大鼠血中1L-β、1L-6和TNF-α因子表达均显著增加,差异具有统计学意义(P0.01);与MCAO模型组相比,灌胃给与CAE-L、CAE-M和CAE-H组的MCAO模型大鼠血中炎症因子1L-β、1L-6和TNF-α均有不同程度的降低,差异具有统计学意义(P0.01);与Sham组相比,MCAO模型组大鼠脑组织内Nrf2和HO-1蛋白的相对表达量均有所增加,HO-1蛋白表达量显著增加,而Nr2蛋白表达增加不显著。与MCAO模型组比较,CAE高、中、低剂量组均可显著上调Nrf2和HO-1蛋白的相对表达量,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:从药效物质基础角度而言,药效活性成分损失必然导致整体药效的损失,同理五苓汤主要缺失成分对氧糖剥夺的星形胶质细胞水肿模型和大鼠大脑中动脉栓塞的脑水肿模型均具有明显的缓解作用,这些成分的损失必然会导致五苓汤方的临床疗效,提示“五苓方以散不宜汤的作用机制是由于水对低极性成分提取能力有限而导致五苓汤存在多种低极性化合物分子损失”的假说得到初步验证。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R285
【图文】：

化学结构式,对照品,化合物,生物科技

１．２试剂逡逑色谱级乙腈（Ｆｉｓｈｅｒ北京康博顺达生物科技有限公司），色谱级甲醇（Ｆｉｓｈｅｒ逡逑北京康博顺达生物科技有限公司），无水乙醇（分析纯，北京新合联创贸易有限逡逑公司），９５％乙醇（分析纯，北京新合联创贸易有限公司），蒸馏水等。逡逑１．３仪器逡逑Ａｇｉｌｅｎｔ邋１２００邋系列高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔｃｏｍｐａｎｙ），ＮｅｗＣｌａｓｓｉｃＭＳ邋分析逡逑天平（ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＥＤ⑴，５００克摇摆式中药粉碎机（长沙市常宏制药机械逡逑设备厂），Ｈｅｉ－ＶＡＰＡｄｖａｎｔａｇｅ型Ｈｅｉｄｏｌｐｈ旋转蒸发仪（德国海道夫公司），微孔逡逑滤膜，移液枪，容量瓶等。逡逑２方法逡逑２．１样品溶液的制备逡逑

泽泻醇B,样品,泽泻,泽泻醇

逦五茶散同方汤剂关键缺失成分入血吸收研究及其抗脑水肿活性评价逦逡逑表２－１不同产地泽泻中２３－乙酰泽泻醇Ｂ含量逡逑江西泽泻逦四川泽泻逡逑化学成分逦保留时间逦含量逦保留时间逦含量逡逑（ｔＢ）逦（％）逦（ｔＢ）逦（％）逡逑２３－乙酰泽泻醇邋Ｂ逦２１．６３４逦０．１５４逦２１．６８９逦０．３３９逡逑＇２１．４６１逡逑

桂皮醛,香豆素,桂枝,样品

图２－２不同样品中２３－乙酰泽泻醇Ｂ的ＨＰＬＣ图逡逑（Ａ对照品；Ａ，江西泽泻；四川泽泻）逡逑表２－２不同产地桂枝中桂皮醛和香＿ａ素含量逡逑福建桂枝逦广西桂枝逦广东桂枝逡逑化学成分逡逑保留时间逦含量逦保留时间含量逦保留时间逦含量逡逑（ｔＢ）逦（％）逦（ｔＢ）逦（％）逦（ｔＢ）逦（％）逡逑桂皮醛逦１４．６６８逦０．７８７逦１４．６７６逦０．７６６逦１４．６３１逦１．３７０逡逑香豆素逦８．１５２逦０．１２７逦８．１５４逦０．１２８逦８．１３６逦０．１５６逡逑

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