黄芪甲苷对辐射诱导脑细胞抗凋亡机理初探

发布时间：2020-07-29 21:29

【摘要】：天然药物具有多靶点和低毒性的特点,因此可作为潜在的神经保护剂。皂苷对神经系统疾病和损伤的神经保护作用的报道越来越多:其可通过直接促进细胞存活、改善突触可塑性来促进神经调节网络再生。辐射诱发大脑氧化应激水平和炎症反应的发生,从而影响认知功能和神经元的结构,最终会导致神经发生、分化和细胞凋亡的异常变化。黄芪甲苷(AS-Ⅳ)是黄芪主要活性成分之一,以抗氧化、抗高血压、抗糖尿病、抗梗塞、抗炎症、抗凋亡和促进伤口愈合、血管再生等一系列保护作用而闻名。大量文献表明,AS-Ⅳ抗凋亡的作用与改善中枢神经系统各种疾病有关,但目前关于AS-Ⅳ对辐射诱导神经细胞凋亡的保护机制鲜有研究报道。本研究通过辐射造模,探讨AS-Ⅳ对辐射诱导的体内外脑细胞凋亡的抗性机制,为抗辐射的中药材活性分子和脑保健品的开发提供理论基础。方法:1.体内试验:以昆明小鼠为研究对象,随机分为5组,每组20只:空白对照组(Control)、溶剂组(DMSO)、溶剂+辐射组(DMSO+R)、低浓度AS-Ⅳ+辐射组(AS-Ⅳ-L+R)、高浓度AS-Ⅳ+辐射组(AS-Ⅳ-H+R)。试验采用腹腔注射的方法,每天一次,进行给药。Control组给予生理盐水,DMSO组和DMSO+R组都给予DMSO,且终浓度不能超过0.01%。AS-Ⅳ-L+R组和AS-Ⅳ-H+R组给药量分别为20 mg/kg和40 mg/kg,给药30 d后,进行8 Gy ~(60)Coγ射线全身一次性均匀辐射。辐射一周后,采集大脑组织样和分子样。大脑切片进行TUNEL染色显示凋亡情况,Western Blotting检测小鼠脑组织凋亡相关蛋白表达量的变化。2.体外试验:以神经样细胞PC12为研究对象,分为5个组:空白对照组(Control)、溶剂组(DMSO)、溶剂+辐射组(DMSO+R)、低浓度AS-Ⅳ+辐射组(AS-Ⅳ-L+R)、高浓度AS-Ⅳ+辐射组(AS-Ⅳ-H+R)。Control组不做任何处理,DMSO组和DMSO+R组都给予DMSO,且终浓度不能超过0.01%。AS-Ⅳ-L+R组和AS-Ⅳ-H+R组给药量分别为25μg/mL和50μg/mL,细胞贴壁后,加药,长至70%?80%后进行紫外辐射处理,剂量为6.5 J/cm~2。流式细胞术检测PC12细胞凋亡情况,Western Blotting检测PC12细胞凋亡相关蛋白表达量的变化。结果:1.体内试验:小鼠大脑切片TUNEL染色结果显示:与Control组相比,DMSO+R组中细胞凋亡率极显著上升(P0.001),与DMSO+R组相比,AS-Ⅳ-H+R组细胞凋亡率下降,差异具有显著性(P0.05)。Western Blotting的结果显示:与Control组相比,DMSO+R组的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈现显著上升趋势(P0.05;P0.01);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平和Bax与Bcl-2的比值均呈现显著上升趋势(P0.05;P0.001;P0.001;P0.001);JNK和p38的蛋白表达水平没有显著性差异(P0.05)。与DMSO+R组相比,AS-Ⅳ-L+R组的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈现显著下降趋势(P0.05);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平和Bax与Bcl-2的比值均呈现显著下降趋势(P0.05;P0.001;P0.001;P0.01);JNK和p38的蛋白表达水平没有显著性差异(P0.05)。2.体外试验:流式细胞术结果显示,与Control组相比,DMSO+R组中细胞凋亡率极显著上升(P0.001),与DMSO+R组相比,AS-Ⅳ-H+R组细胞凋亡率下降,差异具有显著性(P0.01)。Western Blotting的结果显示:与Control组相比,DMSO+R组的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈现显著上升趋势(P0.001);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平和Bax与Bcl-2的比值均呈现显著上升趋势(P0.001;P0.001;P0.001;P0.01);JNK和p38的蛋白表达水平没有显著性差异(P0.05)。与DMSO+R组相比,AS-Ⅳ-L+R组的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈现显著下降趋势(P0.01);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平和Bax与Bcl-2的比值均呈现显著下降趋势(P0.001;P0.001;P0.01;P0.01);JNK和p38的蛋白表达水平没有显著性差异(P0.05)。结论:1.AS-Ⅳ可有效降低辐射诱导脑细胞的凋亡。2.AS-Ⅳ对辐射诱导脑细胞抗凋亡的作用机制可能与JNK-p38的磷酸化调节有关。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

小鼠大脑,细胞凋亡,染色法

色法显示 AS-Ⅳ对辐射诱导小鼠大脑细胞凋亡的影响图（标尺为 50 μm）。（B）小鼠大脑细胞凋亡凋亡率统/组，*** P < 0.001，* P < 0.05。ELstaining showed the effect ofAS-Ⅳ on apoptosis of micUNELstaining map of mouse brain tissue sections (scale 5ptotic apoptosis rate of mouse brain cells. n = 3, *** P < 0.射诱导小鼠大脑细胞凋亡相关蛋白表达的影响验结果如图 3-2A 所示，AS-Ⅳ对辐射诱导小鼠体情况如下：组相比，DMSO+R 组的 JNK 和 p38 的蛋白磷酸-2C：P<0.05；图 3-2E：P<0.01）；p53、Caspa和 Bax 与 Bcl-2 的比值均呈现显著上升趋势（图.001；图 3-2I：P< 0.001；图 3-2G：P< 0.001）；显著性差异（图 3-2B：P>0.05；图 3-2D：P>

统计图,小鼠大脑,磷酸化,相关蛋白

24图 3-2 AS-Ⅳ对辐射诱导小鼠大脑细胞凋亡相关蛋白表达及其磷酸化水平的影响。（A）为凋亡相关蛋白及其磷酸化水平的 Western Blotting 检测图。（B-I）分别为小鼠大脑中 JNK、p-JNK、p38、p-p38、p53、Bax/Bcl-2、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白相对灰度值变化统计图。n > 3，*** P < 0.001，** P < 0.01，* P < 0.05。Figure 3-2 Effect ofAS-Ⅳ on apoptosis-related protein expression and phosphorylation in brainof radiation-induced animal models. (A) Western Blotting assay for apoptosis-related proteins andtheir phosphorylation levels. (B-I) Statistical plots of relative gray value changes of JNK, p-JNK,p38, p-p38, p53, Bax / Bcl-2, Caspase-9 and Caspase-3 proteins in animal models, respectively.n > 3, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.

散点图,细胞凋亡,散点图,情况

26图 3-3 AS-Ⅳ对辐射诱导 PC12 细胞凋亡水平的影响。（A-E）为 Control 组、DMSO 组、DMSO + R 组、AS-Ⅳ-L+ R 组和 AS-Ⅳ-H + R 组的 PC12 细胞凋亡情况散点图。（F）上述每组 PC12 细胞凋亡情况统计结果图。n > 3，*** P < 0.001，** P < 0.01。Figure 3-3 Effect ofAS-Ⅳ on radiation-induced apoptosis in PC12 cells. (A-E) Scatter plot ofPC12 cell apoptosis in Control group, DMSO group, DMSO + R group,AS-Ⅳ-L+ R group andAS-Ⅳ-H + R group. (F) Statistical results of apoptosis in each group of PC12 cells. n > 3, *** P <0.001, ** P < 0.01.

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