益气养阴通络中药复方干预类风湿关节炎的疗效及作用机制研究

发布时间：2020-07-29 23:46

【摘要】：背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以多关节受累为主要表现的慢性自身免疫性疾病,我国患病率约为0.32%-~0.36%,而发病后一年RA患者的致残率高达20%,是造成人群劳动力丧失的主要疾病之一。目前临床上常用的治疗药物主要有激素类药物、非甾体类抗炎药、生物制剂等。对于RA的治疗,我国RA患者达到低疾病活动度及临床缓解率远低于预期,开发安全有效低毒的药物具有重要的意义。祖国医学在治疗本病方面可改善症状,协助西药控制病情,且不良反应较少。吾师认为类风湿关节炎病程超过5年或应用糖皮质激素治疗后,易出现气阴两虚的证候表现,这些表现不能用以往的证型分类解释。在《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》中,吾师主要负责类风湿关节炎气阴两虚型诊治部分的撰写工作。基于益气养阴法的理论与临床依据,并结合导师多年临证经验,最终确立治则为益气养阴通络法,方药为四神煎。四神煎收载于清代鲍相之《验方新编》,具有益气养阴,通络止痛的功效,可改善RA患者关节疼痛、晨僵、乏力、继发的口眼干燥等症状,在大量临床应用过程中疗效显著,但目前国外尚无本法治疗类风湿关节炎机制研究,国内相关动物实验研究也较少。RA的近年机制探索,多集中在炎症信号通路调控上,众多炎症细胞因子直接或间接参与关节的炎症反应。而起主要作用的是促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6等。核转录因子IRAK1/IKK/NF-κB通路、JAK2-STAT3通路是主要参与发病的炎症通路,也是近年研究热点之一。本实验研究以上述现状为出发点,首先验证四神煎治疗效果,为益气养阴通络法改善类风湿关节炎的炎症方面提供重要依据,并通过转录因子IRAK1/IKK/NF-κB通路、JAK2-STAT3通路探讨本法治疗类风湿关节炎的作用机制,旨在用科学的方法揭示中医药在该病治疗作用方面的独特优势、为中西医结合治疗RA进行一些新的尝试,为未来新药创制提供第一手研究资料。目的:观察益气养阴通络法对类风湿关节炎SD大鼠炎症指标的影响、探讨IRAK1/IKK/NF-κB、JAK2-STAT3通路的影响及作用机制。方法:SPF级SD大鼠50只,雄性,普通饲料喂养,随机分为5组,每组10只。即正常对照组、模型组、四神煎组、四神煎加甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组,用佐剂关节炎法造模成AIA大鼠,持续给药8周。本实验分三部分。实验一:益气养阴通络法对类风湿关节炎大鼠炎症表达的影响1.测定不同组别SD大鼠踝关节肿胀度。2.用光镜观察不同组别SD大鼠踝关节滑膜组织病理学改变。3.观察不同组别SD大鼠关节炎指数变化。4.ELISA法测不同组别SD大鼠血清CRP、ESR、IL-1、IL-6、TNF-α水平。实验二:益气养阴通络法对类风湿关节炎大鼠IRAK1/IKK/NF-κB信号通路的影响。Western blot实验分析大鼠滑膜组织中IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测大鼠滑膜组织中IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平。实验三:益气养阴通络法对类风湿关节炎大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响1.Western blot法检测大鼠滑膜组织中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测大鼠滑膜组织中JAK2、STAT3mRNA表达水平。2.Western blot法检测大鼠滑膜组织中SOCS3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测大鼠滑膜组织中SOCS3mRNA表达水平。结果:1.与正常组相比,模型组踝关节肿胀度明显升高,差异有统计学意义(P0.05);治疗8周后,与模型组相比,四神煎组踝关节肿胀度明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组踝关节肿胀度明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组踝关节肿胀度与甲氨蝶呤组相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组踝关节肿胀度明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义。2.与正常组相比,正常组大鼠细胞排列整齐,踝关节软骨表面光滑无破坏,滑膜组织结构完整无破坏,无炎性细胞浸润及血管增生性症状;模型组大鼠软骨组织结构遭到破坏,滑膜细胞增生变形、纤维化,细胞排列紊乱,有大量炎性细胞浸润增生及滑膜血管翳形成;大鼠滑膜组织表面增厚,可见炎性细胞浸润,滑膜细胞排列紊乱,有血管翳形成及少数软骨破坏;四神煎组、甲氨蝶呤组软骨破坏减轻,其滑膜组织增生较前减轻,所观察到的细胞形态稍有紊乱,血管翳形成减轻;四神煎+甲氨蝶呤组大鼠软骨组织相对光滑无破坏,滑膜细胞结构与形态相对正常,细胞排列相对整齐,无血管翳形成。3.与正常组相比,模型组造模成功后的踝关节炎指数评分明显升高,差异有统计学意义(P0.05),与模型组相比,四神煎组踝关节炎指数评分明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组关节炎指数评分明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组踝关节炎指数评分相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组踝关节炎指数评分明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。4.与正常组相比,模型组C反应蛋白、血沉水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组C反应蛋白、血沉水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组C反应蛋白、血沉水平明显明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组C反应蛋白、血沉水平相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组C反应蛋白、血沉水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。5.与正常组相比,模型组TNF-α、IL-1、IL-6水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组的TNF-α、IL-1、IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组的TNF-α、IL-1、IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组的TNF-α、IL-1、IL-6水平相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组TNF-α、IL-1、IL-6水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。6.与正常组相比,模型组IRAK1、TRAF6、IKK、NF-KB p65蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组IRAK1、TRAF6、IKK、p65NF-κB蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。7.与正常组相比,模型组IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。8.与正常组相比,模型组p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组的p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组的p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平相当,差异无统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。9.与正常组相比,模型组JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,四神煎组的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎组与甲氨蝶呤组的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平相当,差异无统计学意义(p0.05);与甲氨蝶呤组相比,四神煎+甲氨蝶呤组JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明显低于甲氨蝶呤组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.益气养阴通络中药复方四神煎可改善类风湿关节炎大鼠炎症;益气养阴通络法是治疗类风湿关节炎的有效方法;四神煎加甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎大鼠疗效优于单用甲氨蝶呤;四神煎治疗类风湿关节炎大鼠与甲氨蝶呤疗效大致相同;四神煎加甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎大鼠疗效优于单用甲氨蝶呤;益气养阴通络中药复方四神煎可以通过抑制TNF-α、IL-1、IL-6因子水平进而改善类风关节炎大鼠炎症。2.益气养阴通络中药复方四神煎通过对IRAK1/IKK/NF-κB信号通路的抑制可能是类风湿关节炎的抗炎机制之一。3.益气养阴通络中药复方四神煎通过对JAK2-STAT3信号通路及其负反馈因子SOCS3表达的抑制可能是类风湿关节炎的抗炎机制之一。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

类风湿关节炎,甲氨蝶呤,肿胀度,踝关节

D E图 1 四神煎对类风湿关节炎大鼠踝关节肿胀度的影响A：正常组；B：模型组；C：四神煎组；D 甲氨蝶呤组；E：四神煎+甲氨蝶呤组；3.四神煎对类风湿关节炎大鼠关节炎指数评分的影响如图 2 所示，与正常组相比，模型组造模成功后的踝关节炎指数评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，四神煎组踝关节炎指数评分明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+四神煎组关节炎指数评分明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与甲氨蝶呤组相比，四神煎组与甲氨蝶呤组踝关节炎指数评分相当，差异无统计学意义（P＞0.05）；与甲氨蝶呤组相比，四神煎+甲氨蝶呤组踝关节炎指数评分明显低于甲氨蝶呤组，差异有统计学意义(P＜0.05）。

类风湿关节炎,大鼠,滑膜组织,滑膜细胞

图 2 四神煎对于类风湿关节炎大鼠关节炎指数的影响（ x ±s，n=10）4.四神煎对类风湿关节炎大鼠踝关节滑膜组织病理学影响由 HE 染色图图 3 可知：与正常组相比，正常组大鼠细胞排列整齐，踝关节软骨表面光滑无破坏，滑膜组织结构完整无破坏，无炎性细胞浸润及血管增生性症状；模型组大鼠软骨组织结构遭到破坏，滑膜细胞增生变形、纤维化，细胞排列紊乱，有大量炎性细胞浸润增生及滑膜血管翳形成；大鼠滑膜组织表面增厚，可见炎性细胞浸润，滑膜细胞排列紊乱，有血管翳形成及少数软骨破坏；四神煎组、甲氨蝶呤组软骨破坏减轻，其滑膜组织增生较前减轻，所观察到的细胞形态稍有紊乱，血管翳形成减轻；四神煎+甲氨蝶呤组大鼠软骨组织相对光滑无破坏，滑膜细胞结构与形态相对正常，细胞排列相对整齐，无血管翳形成。如下图 3 所示,各组 HE 染色病理切片图片。

类风湿关节炎

四神煎对类风湿关节炎大鼠病理组织学的影响

【参考文献】