银杏多糖对小鼠乳腺癌4T1细胞的抑制作用及GLUT1表达的作用研究

发布时间：2020-08-01 16:34

【摘要】：背景:乳腺癌是女性中一种常见的高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。目前乳腺癌治疗以手术切除、放化疗为主,但由于放化疗毒副作用强,并且癌症患者预后不良,使得乳腺癌的治疗效果并不理想。因此,寻求和开发安全性强、毒副作用小的抗肿瘤药物已成为癌症治疗的关键。银杏多糖是从银杏叶、银杏果和银杏外种皮中提取的活性物质,被证实在抗肿瘤、调节免疫、抗过敏、降血脂以及辅助放化疗等方面发挥关键作用,受到越来越多学者的关注。大量研究表明,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移是临床上癌症治疗的关键。随着肿瘤细胞能量代谢分子机制研究的不断深入,通过研发小分子乳腺癌抑制剂,阻断肿瘤细胞糖酵解途径,是靶向治疗乳腺癌的新思路。2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)是人工合成的己糖激酶抑制剂,能竞争性抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄取,阻断糖酵解途径。临床研究表明,虽然2-DG具有良好的抑制癌细胞增殖的效果,但因其具有较强的毒性作用,很难应用于临床治疗,所以现在研究着重于2-DG与阿霉素、紫杉醇等其他抗肿瘤药物联合使用,并且已经取得了一定的成效。目的:探讨银杏多糖与2-DG单独及联合使用对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。方法:不同浓度银杏多糖与2-DG单独及联合使用,处理对数生长期4T1细胞,MTT法和台盼蓝拒染法分别检测细胞增殖抑制和细胞毒性作用;DAPI核染色法检测细胞凋亡;RT-PCR检测细胞内葡萄糖转运蛋白家族m RNA表达;Western blot检测细胞内葡萄糖转运蛋白-1表达。结果:MTT法结果显示,不同浓度银杏叶多糖、银杏外种皮多糖和2-DG都呈剂量时间依赖性抑制4T1细胞增殖,其半数抑制浓度分别为196.423mg·L-1、484.231mg·L-1和389.265mg·L-1,对细胞的最大抑制率分别为(69.24±2.14)%、(59.08±3.56)%和(72.36±3.23)%,与对照组相比均有极显著差异,400mg·L-12-DG分别与800mg·L-1银杏白果多糖、200mg·L-1银杏叶多糖和500mg·L-1银杏外种皮多糖联合使用,细胞抑制率分别为(43.26±1.22)%、(59.32±1.51)%和(56.62±2.36)%,与对照组相比均有极显著差异;台盼蓝拒染法结果显示,随着银杏多糖和2-DG剂量的增加,细胞活力显著下降、毒性显著增强,当银杏叶、银杏外种皮多糖和2-DG剂量达到800mg·L-1,细胞存活率分别减小至(12.29±0.34)%、(14.58±0.59)%和(39.85±2.36)%,与对照组相比均有极显著差异,400mg·L-12-DG分别与800mg·L-1银杏白果多糖、200mg·L-1银杏叶多糖和500mg·L-1银杏外种皮多糖联合使用,细胞存活率依次为(81.24±2.21)%、(73.56±2.26)%和(78.52±3.21)%,与对照组相比无显著性差异,提示银杏多糖与2-DG联合使用不增强细胞毒性作用;DAPI核染色结果显示,2-DG本身不诱导细胞凋亡,单独使用银杏多糖及与2-DG联合使用对4T1细胞有明显的诱导凋亡作用;RT-PCR结果显示,银杏多糖与2-DG单独及联合使用可以显著降低细胞内葡萄糖转运蛋白-1m RNA的表达;Western blot结果显示,银杏多糖与2-DG单独及联合处理可以显著降低葡萄糖转运蛋白-1蛋白水平的表达。结论:银杏多糖与2-DG联合使用能抑制4T1细胞的增殖、诱导细胞凋亡,并通过调节葡萄糖转运蛋白-1的表达,干预癌细胞的能量代谢。提示银杏多糖抑制4T1细胞增殖、诱导细胞凋亡很可能通过干预葡萄糖转运蛋白的表达实现的。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

能量代谢,细胞代谢,糖酵解,肿瘤细胞

第一章前言糖酵解调节的影响(Shakespear et al. 2018)。事实上，许多肿瘤细胞在保持线粒呼吸的同时表现出 Warburg 效应(Tang et al. 2018)。癌细胞对糖酵解速率的增加其不同于正常细胞的主要原因(图 1-1）。随着对肿瘤细胞能量代谢研究的不断入，越来越多的学者发现 Warburg 效应与线粒体 DNA、癌基因和肿瘤抑制因的改变密切相关(Lee et al. 2015)。

肿瘤抑制基因,癌基因,相关信号,癌细胞

沈阳农业大学硕士学位论文谢底物，虽然谷氨酰胺不是糖酵解必需的，但当糖酵解途径被阻断后，谷氨酰胺可以替代糖酵解途经完成肿瘤细胞能量代谢(Moudi et al. 2018)。谷氨酰胺提供三羧酸(tricarboxylic acid cycle, TCA)循环的中间体，为其他生物合成提供基础。因此，肿瘤细胞依赖谷氨酰胺维持 TCA 循环，就如同肿瘤细胞依赖葡萄糖维持有氧糖酵解(Shao et al. 2018)。许多研究表明，当肿瘤细胞能量代谢方式发生改变，就需要葡萄糖提供更多的能量来维持肿瘤生长。因此，抑制糖酵解代谢途径可能是抑制肿瘤细胞生长和增殖的最关键因素。此外，也可以通过阻断与糖酵解有关的生物合成途径抑制细胞增殖。这些结果表明靶向糖酵解可能是防止癌症发展的有效途径(Wang et al. 2018c)。癌基因的异常激活和肿瘤抑制因子基因突变，可以显著影响肿瘤细胞能量代谢过程酶的活性，并且在癌症的有氧糖酵解中起关键作用。磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase andtensinhomology deleted on chromosome ten, PTEN)，Myc 和 p53 都可以影响细胞代谢（图 1-2）。

葡萄糖代谢,肿瘤细胞

但同时也增强线粒体呼吸作用，导致癌细胞整体代谢功能增加(Zhai etal. 2018)。肿瘤抑制因子 p53 可能是癌症中发现的基因突变频率最高的一类蛋白质分子，除了调控细胞周期和诱导细胞凋亡的作用外，p53 还能直接上调促进氧化磷酸化的细胞色素 C 氧化酶 2 的活性。因此，p53 的缺失将代谢转变为线粒体呼吸，作用于肿瘤细胞糖酵解途径(Awasthi et al. 2018)。1.2.3 靶向抗肿瘤药物研究进展对肿瘤细胞能量代谢的研究是癌症靶向治疗的关键，越来越多的学者将关注点转向了特异性阻断肿瘤细胞糖酵解途径中某一关键代谢步骤和抑制肿瘤生长的小分子物质的研究。已有研究表明，阻断糖酵解代谢途径有助于防止癌症的侵袭、转移和扩散(沈培亮等 2016)。在癌症靶向治疗中，可以通过降低糖酵解途径 HK、PFK 和丙酮酸激酶(yruvate kinase, PK)等限速酶活性达到抑制癌细胞增殖的效果(图 1-3)。已有越来越多的研究学者将目光转向阻断肿瘤细胞糖酵解的研究。目前， 2-DG 、 3- 溴丙酮酸 (3-bromopyruvate, 3-BrPA) 和龙胆胺(1-(2,4-Dichlorobenzyl)indazole-3-carboxylic acid, LON)等 HK 抑制剂的研究还处于临床早期试验阶段。

【参考文献】