胡黄连苷Ⅱ抗脑缺血再灌注损伤作用及其机制研究

发布时间：2020-08-01 15:55

【摘要】：目的:脑卒中(cerebral stroke)是临床上的常见病、多发病,是目前临床上三大致死疾病之一,也是首位致残因素。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)占全部脑卒中的60%~80%,严重威胁人类健康,已成为医药学界的热点研究课题。缺血性脑卒中的发病机制迄今尚未完全明确,亦无疗效确切的治疗药物。因此,国内外学者一直致力于寻找能够拮抗脑卒中病理过程的药物,探索其药效和作用机制,以期为治疗脑卒中提供新的选择。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,以神经功能学评分、脑水肿程度、梗死体积百分率、脑组织病理形态学变化、脑组织神经细胞及微血管超微结构、血管渗漏程度为主要评价指标,观察脑缺血再灌注过程中胡黄连苷Ⅱ(picroside Ⅱ)拮抗氧化损伤、保护血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的作用,通过对活性氧(reactive oxygen species,ROS)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH氧化酶)及相关基因表达的检测,以及对血脑屏障相关因子的基因和蛋白表达的检测,从细胞、分子、基因水平探讨胡黄连苷Ⅱ对抗氧化损伤和保护血脑屏障的作用及机制,为胡黄连苷Ⅱ发展成为治疗缺血性卒中的新型脑保护剂提供理论基础和依据。方法:本研究采用经典的线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,造成大鼠的局灶性脑缺血再灌注损伤。实验大鼠随机分为假手术组、局灶性脑缺血再灌注损伤(模型)组、胡黄连苷Ⅱ(治疗药物)组、夹竹桃麻素(阳性对照药物)组、胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素(共同作用)组。各组于缺血再灌注后腹腔注射给药,假手术组和模型组同步给予腹腔注射生理盐水,共进行以下四部分实验:1.胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的保护作用主要从药效学方面观察胡黄连苷Ⅱ对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。(1)神经功能学评价:脑缺血2h再灌注22h后,参照改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score points,mNSS)法进行神经功能评分,检测动物神经损伤程度。(2)脑含水量的测定:采用干湿称重法测定脑含水量。(3)脑梗死体积的测定:采用氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法测定大鼠脑梗死体积百分比。(4)病理组织学检查:脑缺血2h再灌注22h后,将大鼠快速全身灌流固定,断头取脑,将大脑皮质部位行冠状切块,固定过夜,常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。将蜡块切成4μm连续冠状切片后进行苏木精伊红(hematoxylin eosine,HE)染色,光学显微镜下观察脑组织病理形态学变化。(5)通过电镜观察大脑皮质区神经元形态结构的改变:取缺血侧皮层制备1mm×1mm×1mm脑组织,用戊二醛固定24h后,经漂洗,锇酸后固定后,切成50nm超薄切片,于电镜下观察。2.胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的保护作用机制(1)ROS含量和NADPH氧化酶活性的检测:应用ELISA试剂盒检测ROS含量和NADPH氧化酶活性。(2)Rac-1、Nox2蛋白表达的检测:Western-blot法检测Rac-1、Nox2的蛋白表达,一抗分别采用小鼠抗大鼠、兔抗大鼠的单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠、羊抗兔的IgG,以β-actin作为内参。发光显影,凝胶成像分析系统(Biospectrum 810 Imaging system,UVP,USA)测定各条带的灰度值。(3)Rac-1、Nox2 mRNA表达的检测:取缺血侧大脑皮质脑组织,用Trizol试剂提取总RNA,取2μg进行RT-PCR反应,以b-actin作为参照检测Rac-1、Nox2 mRNA的表达。3.胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障的保护作用主要从细胞水平观察胡黄连苷Ⅱ对血脑屏障的保护作用。(1)通过电镜观察硝酸镧在毛细血管的渗漏程度:造模后,静脉注入0.5ml 2%硝酸镧-生理盐水,镧醛固定液固定,取缺血大脑皮层脑组织,切块后,经固定、切片、干燥后,电镜观察BBB超微结构。(2)脑缺血再灌注损伤后,血脑屏障渗漏程度的测定:应用荧光法测定伊文思蓝的渗漏率。4.胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障的保护作用机制(1)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5 mRNA表达的检测:分离缺血侧脑组织的皮质,用Trizol试剂提取总RNA,取2μg进行RT-PCR反应,以b-actin作为参照检测ROCK、MLCK、MMP-2、Claudin-5 mRNA的表达。(2)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5蛋白表达的检测:Western-blot法检测ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5的蛋白表达,一抗分别采用兔抗大鼠、小鼠抗大鼠的单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、兔抗小鼠的IgG,以β-actin作为内参。发光显影,凝胶成像分析系统测定各条带的灰度值。结果1.胡黄连苷Ⅱ对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用(1)神经功能评分:假手术组大鼠无明显的神经功能缺损,模型组大鼠可观察到明显的神经功能缺陷,与模型组相比,胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组的神经功能学评分均明显降低(P值均0.05),且以上三组的mNSS分值无显著性差异(P0.05)。(2)脑梗死体积及含水量的测定:假手术组大鼠的脑组织无明显梗死灶,模型组出现白色大面积梗死灶(P0.01)。双侧大脑半球不对称,左侧大脑半球有明显的水肿表现。胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组与模型组相比,梗死体积均有明显的降低(P值均0.01)。胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组的脑梗死体积与胡黄连苷Ⅱ组相比,亦有明显的降低(P0.05),说明两药在降低脑梗死体积方面有一定的协同作用;胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组的脑水肿程度和脑含水量与模型组相比也有明显的降低。从降低脑梗死体积和脑水肿程度方面来评价,20mg/kg剂量的胡黄连苷Ⅱ与50mg/kg剂量的夹竹桃麻素相比,效果相当。对于降低脑梗死体积程度,两药协同具有更显著的作用。(3)病理组织学检查:假手术组大鼠脑组织皮质区神经细胞分布均匀,排列整齐,结构完整,着色均匀。模型组大鼠脑组织皮质区神经细胞排列紊乱,细胞核固缩、着色加深,变形坏死后形成大量空泡。胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组、胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组大鼠神经细胞分布较均匀,排列较规整,轮廓尚清晰,结构较完整,着色均匀,此三组的变性细胞指数(denatured cells index,DCI)较模型组显著降低(P0.05),但此三组的DCI之间无显著性差异(P0.05)。(4)应用电镜观察大鼠大脑皮质区神经元的形态、结构的改变:假手术组神经元形态清晰完整,模型组神经元以及细胞器各结构均有皱缩、松散,损伤明显。胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组细胞皱缩、细胞器损伤均明显减轻。2.胡黄连苷Ⅱ对脑缺血再灌注保护作用机制(1)大鼠大脑皮质组织中ROS产量和NADPH氧化酶活性的检测:与假手术组相比,模型组大鼠大脑皮质组织中ROS产量显著增加(P0.001),NADPH氧化酶活性明显升高(P0.001),而胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均明显降低了ROS含量和NADPH氧化酶活性(P值均0.01),且以上三组在降低ROS产量和NADPH氧化酶活性方面无显著性差异(P0.05)。(2)Rac-1和Nox2蛋白表达的检测:与假手术组相比,模型组大鼠大脑皮质组织中Rac-1和Nox2蛋白表达明显升高(P值均0.01),而胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均能明显降低Rac-1和Nox2蛋白的表达(P值均0.01),且以上三组在降低Rac-1和Nox2蛋白的表达方面无显著性差异(P0.05)。(3)Rac-1和Nox2的mRNA表达的检测:假手术组仅有少量Rac-1和Nox2的m RNA的表达。与假手术组相比,模型组的mRNA表达明显增强(P值均0.01),而胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均可降低Rac-1和Nox2的mRNA的表达(P值均0.05),且以上三组在降低Rac-1和Nox2的m RNA的表达方面无显著性差异(P0.05)。3.胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障的保护作用(1)通过电镜观察硝酸镧在脑毛细血管中的渗出情况:假手术组血管结构完整,硝酸镧均在血管腔内,没有渗出至血管外侧。模型组毛细血管结构被破坏,通透性增大,硝酸镧渗出至毛细血管外组织间隙中。胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组的硝酸镧聚集在管腔内侧的紧密连接处,并未渗出至血管外侧的组织间隙中,脑毛细血管的损伤明显减轻。(2)脑组织中EB的含量测定:假手术组大鼠脑内几乎无EB渗出。与假手术组相比,模型组大鼠脑组织的EB含量显著升高(P0.001),表明血脑屏障损伤严重。胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均可显著减少脑组织中EB含量(P值均0.01),且以上三组的EB含量无显著性差异(P0.05)。4.胡黄连苷Ⅱ对脑缺血再灌注后血脑屏障的保护作用机制(1)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5的mRNA表达的检测:假手术组仅有少量ROCK、MLCK和MMP-2的mRNA表达,而模型组的表达明显增强(P值均0.05),胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均可明显降低ROCK、MLCK和MMP-2的mRNA的表达(P值均0.05),且以上三组在降低ROCK、MLCK、MMP-2的mRNA的表达方面无显著性差异(P0.05)。Claudin-5m RNA在假手术组有大量表达,在模型组大鼠大脑皮质组织中表达明显降低(P0.01),胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均能明显提高Claudin-5的m RNA表达(P值均0.05),且以上三组在提高Claudin-5的m RNA的表达方面无显著性差异(P0.05)。(2)ROCK、MLCK、MMP-2、Claudin-5蛋白表达的检测:ROCK、MLCK和MMP-2蛋白在假手术组仅有少量表达,模型组大鼠脑组织中此三种蛋白的表达均有显著增加(P值均0.01),胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组此三种蛋白的表达均明显降低(P值均0.05),且以上三组在降低ROCK、MLCK、MMP-2的蛋白表达方面无显著性差异(P0.05)。Claudin-5在假手术组有大量表达,在模型组大鼠大脑皮质组织中表达明显降低(P0.01),胡黄连苷Ⅱ组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷Ⅱ+夹竹桃麻素组均能明显提高Claudin-5的蛋白表达(P值均0.05),且以上三组在提高Claudin-5的蛋白表达方面无显著性差异(P0.05)。结论1.胡黄连苷Ⅱ能够改善脑缺血再灌注大鼠的神经行为功能、降低脑含水量和脑梗死体积,保护脑神经细胞,对实验大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。2.胡黄连苷Ⅱ可能通过降低脑组织中ROS的产量、抑制NADPH氧化酶的活性、降低Rac-1和Nox2的mRNA和蛋白的表达而提高脑组织的抗氧化能力,减轻ROS介导的脑组织损伤,从而对脑缺血再灌注大鼠脑组织产生神经保护作用。3.胡黄连苷Ⅱ能明显减轻脑毛细血管的损伤,减少硝酸镧颗粒和伊文思蓝从脑毛细血管渗漏至脑组织间隙,对脑缺血再灌注后血脑屏障有明显的保护作用。4.胡黄连苷Ⅱ可能通过抑制ROCK、MLCK、MMP-2的mRNA和蛋白的表达,增强Claudin-5的mRNA和蛋白的表达发挥保护血脑屏障的作用。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

神经功能,行为功能,治疗前后,协同作用

手术大鼠经胡黄连苷II治疗后，其mNSS评分明显低于模型组（P<0桃麻素组、胡黄连苷 II+夹竹桃麻素组的评分亦明显低于模型组（P<0.05治疗前后，胡黄连苷 II 组、夹竹桃麻素组以及胡黄连苷 II+夹竹桃麻素组mNSS 评分均无显著性差异(P>0.05)，这提示胡黄连苷 II 与夹竹桃麻素在改鼠神经行为功能方面并没有协同作用。（见图 1.1）

梗死灶,脱氢酶活力,TTC还原,实验大鼠

组织会被染成深红色，而缺血梗塞组织，因其线粒体损伤，脱氢酶活力丧失，不能将TTC还原成TPF，因而梗死灶呈现苍白色。方差分析显示，各组实验大鼠的脑梗死体积有统计学差异（P<0.05），Bonferroni(B)法两两比较显示：如图1.2A、1.2B所示，假手术组大鼠脑组织呈均匀的红色，未见明显梗死灶。模型组大鼠可见大片白色梗死灶（34.75± 4.23%）。胡黄连苷II组、夹竹桃麻素组、胡黄连苷II+夹竹桃麻素组大鼠脑梗死体积（14.12±1.73%, 13.68±1.38%, 4.57±0.62%）均较模型组明显缩小（P<0.05），胡黄连苷II+夹竹桃麻素共同作用组脑梗死体积较胡黄连苷II单独做用组明显缩小（P<0.05）。胡黄连苷II治疗组与夹竹桃麻素阳性对照药物组比较，两组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。

百分率

BTTC染色各组大鼠脑梗死体积百分率

【参考文献】