NLRP3炎症小体在自然衰老大鼠认知功能衰退中的作用及竹节参总皂苷的调节

发布时间：2020-08-02 17:26

【摘要】：目的:(1)研究NLRP3炎症小体在自然衰老大鼠认知功能衰退中的作用。(2)从NLRP3炎症小体途径探讨竹节参总皂苷(Saponins from Panax japonicus,SPJ)对自然衰老大鼠认知功能衰退改善的作用机制方法:实验一:分别取不同年龄阶段的SD雄性大鼠,即青年组(Adult,6M)、中年组(Middle,12M)、老年组(Aged,24M),每组12只,采用旷场、新物体认知和Morris水迷宫方法检测各组大鼠认知功能的变化,场电位记录法检测各组大鼠海马CA1区突触传递长时程增强(Long-term potentiation,LTP)的变化,高尔基染色检测各组大鼠海马树突棘的变化。Western blot法检测各组大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NOD样受体3(NOD-Like receptors 3,NLRP3)、接头蛋白即凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和效应分子半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)的表达变化以及突触可塑性相关蛋白N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚型2A(N-Methyl-D-Aspartate receptor subunit 2A,NMDAR2A)、N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚型2B(N-Methyl-D-Aspartate receptor subunit 2B,NMDAR2B)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体亚单位1(α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole proprionic acid receptor subunit 1,GluA1)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体亚单位2(α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole proprionic acid receptor subunit 2,GluA2)和学习记忆相关蛋白环磷腺苷效应元件结合蛋白(CAMP-response element binding protein,CREB),钙调蛋白激酶II(Calmodulin-dependent protein kinase II,CAMKII)及其磷酸化表达的变化。实验二:将24月龄SD雄性大鼠随机分为老年对照组(Aged,24M)和NLRP3炎症小体抑制剂组(AC-YVAD-CMK),每组10只。另取10只大鼠作为青年对照组(Adult,6M),侧脑室埋管给药,抑制剂组给予对应的NLRP3炎症小体抑制剂(AC-YVAD-CMK),老年对照组与青年对照组分别给予等量的脑脊液,每天给药一次,连续给药三周。采用旷场、新物体认知和Morris水迷宫方法检测各组大鼠认知功能的变化,场电位记录法检测各组大鼠海马CA1区突触传递长时程增强(LTP)的变化。Western blot法检测各组大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化以及突触可塑性相关蛋白GluA1、GluA2和学习记忆相关蛋白CAMKII、CREB及其磷酸化表达的变化。实验三:将18月龄的SD雄性大鼠随机分为3组,即自然衰老组及竹节参总皂苷10mg/kg和30 mg/kg剂量组,每组10只。给药组大鼠从18月龄开始分别灌胃给予10mg/kg和30 mg/kg的竹节参总皂苷,自然衰老组大鼠给予等量的生理盐水,灌胃至24月龄。每周连续灌胃6 d,停药1 d,另取10只6月龄的大鼠作为青年对照组。旷场、新物体认知和Morris水迷宫方法检测各组大鼠认知功能的改变,场电位记录法检测各组大鼠海马CA1区突触传递长时程增强(LTP)的变化。Western blot法检测各组大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化以及突触可塑性相关蛋白GluA1、GluA2和学习记忆相关蛋白CAMKII、CREB及其磷酸化表达的变化。结果:实验一:新物体认知和Morris水迷宫实验结果表明,与青年对照组相比,衰老组大鼠认知功能显著降低(P0.05)。场电位记录结果显示,大鼠海马CA1区LTP损害年龄依赖性升高(P0.05)。高尔基染色结果表明,随着年龄增长,大鼠海马树突棘密度减少,衰老组较青年组有显著差异(P0.05)。Western blot结果显示,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达水平年龄依赖性升高,而突触可塑性相关蛋白NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1、GluA2和学习记忆相关蛋白p-CAMKII、p-CREB表达年龄依赖性显著降低(P0.05或P0.01)。实验二:给与NLRP3炎症小体抑制剂后,结果显示,抑制剂可改善衰老组大鼠的认知功能衰退,减轻衰老组大鼠海马CA1区LTP的受损程度。同时,Western blot结果显示,给与NLRP3炎症小体抑制剂后可降低衰老大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达水平,升高突触可塑性相关蛋白NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1、GluA2和学习记忆相关蛋白p-CAMKII、p-CREB的表达水平(P0.05或P0.01)。实验三:给予衰老大鼠竹节参总皂苷干预后,行为学结果表明,竹节参总皂苷可改善衰老大鼠的认知功能衰退。LTP结果也表明,竹节参总皂苷可减轻衰老大鼠海马CA1区LTP的受损程度。Western blot结果显示,竹节参总皂苷可降低衰老大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达水平;同时,竹节参总皂苷可增强突触可塑性相关蛋白AMPA受体亚型GluA1和GluA2的膜表达,增强衰老大鼠学习记忆相关蛋白CAMKII、CREB的磷酸化表达水平(P0.05或P0.01)。结论:(1)NLRP3炎症小体在自然衰老大鼠认知功能衰退中起重要作用,抑制NLRP3炎症小体激活可改善衰老大鼠认知功能减退。(2)竹节参总皂苷可改善自然衰老大鼠认知功能衰退,其机制可能与其调节NLRP3炎症小体,进而调节AMPA受体(GluA1和GluA2)膜表达,增强学习记忆相关蛋白CAMKII和CREB的磷酸化表达有关。
【学位授予单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

树突棘,神经元,大鼠,青年

三峡大学硕士学位论文注：旷场实验（A，B），图 A 代表各组大鼠旷场实验运动总路程，图 B 代表各组大鼠旷场实验中央区时间占比；新物体认知实验（C），图 C 代表各组大鼠新物体认知实验识别系数；Morris 水迷宫（D-I），D 表示各组大鼠的潜伏期；E 表示各组大鼠的运动路程；F 表示各组大鼠的平均速度；G 表示各组大鼠通过平台的次数；H 表示各组大鼠停留在各个象限的时间；I 表示各组大鼠的运动轨迹。Adult：青年组（6M），Middle：中年组（12M），Aged：老年组（24M）。值表示均数±标准误，与青年组相比，*P<0.05，**P<0.01，n=122 自然衰老大鼠海马区树突棘的变化高尔基染色结果表明，随着年龄的增长大鼠神经元树突的二级分支和末梢分支均在减少，且自然衰老大鼠较青年大鼠有显著性差异（P<0.05，图 A-D）。

树突棘,青年,大鼠,末梢

三峡大学硕士学位论文老年组大鼠海马区神经元树突棘二级分支；图 B 代表各组大鼠神经元树突棘二级分支统计图；图C 代表各组大鼠神经元树突棘末梢分支示意图，a，b，c 别代表青年组大鼠、中年组大鼠、老年组大鼠海马区神经元树突棘末梢分支；图 D代表各组大鼠神经元树突棘末梢分支示统计图。Adult：青年组（6M），Middle：中年组（12M），Aged：老年组（24M）。值表示均数±标准误，与青年组相比，*P<0.053 自然衰老大鼠海马区 LTP 的变化LTP 结果表明青年组大鼠 LTP 为 142.8 ±7.4%，中年组大鼠 LTP 为 130.2 ±4.4%，老年组大鼠 LTP 为 110.3± 5.3%，且老年组大鼠 LTP 较青年组大鼠 LTP 有显著下降（P<0.05，图 A-B）。

曲线,蛋白表达,大鼠,青年

图 4 自然衰老大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达的变化注：图 A 代表各组大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 的免疫条带；图 B 代表海马区 NLRP3 光密度相对值；图 C 代表海马区 ASC 光密度相对值；图 D 代表海马区 Caspase-1 光密度相对值。Adult：青年组（6M），Middle：中年组（12M），Aged：老年组（24M）。值表示均数±标准误，与青年组相比，*P<0.05，**P<0.01，n=45 自然衰老大鼠 NMDA 受体功能的变化结果表明青年组大鼠 NMDAR-fEPSP 为 69.7 ±2.8%，中年组大鼠 NMDAR-fEPSP为51.6 ±3.4%，老年组大鼠NMDAR-fEPSP为39.7±2.3%，老年组大鼠NMDAR-fEPSP较青年组大鼠显著下降（P<0.05，图 A-C）。随着年龄的增长，大鼠 NMDAR-LTP 在下降，其下降的原因可能源于突触前递质释放增加，也可能源于突触后受体的反应性增强。输入输出曲线则反应了突触后受体情况，输入输出曲线结果表明随着年龄增加，大鼠突触后受体减少，老年组大鼠较青年组大鼠相比，有显著性的下降（P<0.05，图D）。以上结果表明，随着年龄的增长，大鼠海马区 NMDAR-LTP 下降的原因可能与突触后受体功能下降有关，而与突触前递质释放无关。随着年龄的增长，大鼠脑内NMDA 受体功能受损增加。

【参考文献】