灵芝采后病原真菌、三萜生物合成及抗氧化活性调控的初步研究

发布时间：2020-08-03 08:02

【摘要】：灵芝(Ganoderma lucidum)为我国传统名贵中药,富含三萜、多糖、氨基酸、生物碱等多种活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、保肝护肝等生物活性。随着人们对灵芝保健功能的认识,灵芝的消费群体已从中国、日本、马来西亚等东南亚国家扩展至欧美西方国家,但野生灵芝资源非常稀少,人工栽培是获得灵芝产品的主要方式。在灵芝子实体生长过程中需要高湿度环境,如果管理不善,会导致病原真菌的感染;而且灵芝采后如不能及时干燥亦会发生霉变,为实现灵芝病原真菌的防治,本研究首先对病变灵芝的主要病原真菌进行研究,分离获得的四株病原真菌菌株,经形态学和rDNA-ITS序列分析确定OTA为黄曲霉Aspergillus flavus,OTB和OTD为青霉菌Penicillium infrabuccalum,OTC为木霉菌Trichoderma sp.。生物学特性研究表明4株病原菌在PDA培养基生长良好,适宜温度为25-30℃;菌株OTA和OTB的最适碳源分别为木糖和葡萄糖,菌株OTC和OTD的最适碳源为果糖和蔗糖;菌株OTA和OTB的最适氮源分别为牛肉膏和尿素,菌株OTC和菌株OTD的最适氮源为NaNO_3和蛋白胨;菌株OTB、OTC和OTD酸性条件生长较好,而pH对OTA的生长影响较小。同时试验了植物精油成分异硫氰酸烯丙酯对病原菌的抑止效果,结果表明异硫氰酸烯丙酯对菌株OTA、OTB、OTC和OTD菌丝的生长具有良好的抑制作用,在20μL/L剂量时,对四株菌株的抑制率均超过97%。灵芝三萜是灵芝中的最主要活性成分之一,其含量的高低直接影响到灵芝的质量,为了提高灵芝子实体中灵芝三萜的含量,本研究在25℃室温条件下,分别采用21、40、60、80、100%浓度的氧以1.5mL/min的流速处理灵芝6天,分析高氧处理对采后灵芝子实体中灵芝三萜生物合成、抗氧化及其DNA损伤保护活性的影响,结果表明,60%氧气浓度可有效减缓失重速度;高氧调控利于灵芝总三萜,黄酮、总酚含量的积累,分别比自然对照组提高了50%-80%;5种三萜单体含量受高氧的影响显著,含量最高的三萜单体为灵芝酸A,约为最低含量灵芝酸C1的10倍;同时高氧使三萜生物合成关键酶基因表达上调:HMGR(3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶)表达量差异性最为显著(P0.01),HMGS(3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A合成酶)表达量最高,OSC(环氧鲨烯环化酶)最低。高氧处理亦明显促进灵芝子实体的体外抗氧化活性,对ABTS、超氧阴离子及羟基自由基清除率均比对照组有显著提高。不同浓度氧处理的灵芝子实体对DNA损伤的保护率在30%-65%,60%氧处理3天的样品具有最高的活性,相较于对照组约上升了1.2倍。因此,高氧处理采后灵芝的最佳条件为60%的氧处理3天。另外,为了增加灵芝三萜化合物的水溶性并在消化液中实现缓释,本研究采用喷雾干燥法制备了灵芝三萜微胶囊,制备微胶囊的工艺为:芯材与壁材的比例为1:2(m/m),壁材为阿拉伯胶和β-环糊精,比例为1:1(m/m),进风温度180℃,流量30ml/min,包埋率可达88.9%。微胶囊化的灵芝三萜释放情况为:模拟肠液模拟胃液口腔模拟液,肠液中在70min达到最大值87.5%。
【学位授予单位】：温州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.31;R285.5;R283.6
【图文】：

灵芝子实体

图 2-1 霉变的灵芝子实体ig.2-1 G. lucidum fruiting body infected by pathogenic fu态学鉴定接种到 PDA 平板上活化后，参考载玻片温室培温箱中培养 3-4 天。利用显微成像系统（BA2、菌丝特征及分支情况等，并拍照。子生物学鉴定 DNA 的提取采用 Ezup 柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒（参考试剂盒说明书：真菌孢子粉末，加入 1.5mL 离心管中，加入LBufferPFrpm 离心 5min，LBuffer，充分颠倒混匀L 无水乙醇，

病原菌,菌株,菌落,形态特征

19图 2-2 病原菌菌株的形态特征观察 2-2 An observation on morphological characters of pathogenic fungi strainTD 在 PDA 培养基上生长较为缓慢且易被感染，点状扩散，黑丝，7 天可长到 2/3，长满后的菌落致密结实，有小的球状隆起小水珠，接触即可浸湿菌落表面，背面有褶皱，分生孢子梗数根弯曲，顶端有分枝，较为膨胀，分生孢子聚生于小梗上，呈卵胞，4.5～6.5μm 1.5～2.5μm 无色至淡色透明。依据病原菌的特征，参考文献，初步鉴定分离菌株 OTC 为木霉属，分离菌株属，分离菌株 OTA 为曲霉。

电泳图,电泳图,菌株,黄曲霉

2-3 ITS1 和 ITS4 区域的 PCＲ扩增产物电泳lectrophoresis of PCR amplified products in ITS分析TS 区通用引物 ITS1 和 ITS4，扩增这 400bp 附近有明显的扩增条带（图 2-3，图菌株 OTB、 marker、菌株 OTC、菌株原菌 ITS 序列与 GeneBank 数据库中的A7.0 采用邻接法构建系统发育树（图 2-MF681598、MH2794 的黄曲霉聚为一支us；OTB、OTD 与 GenBank 中登记的登霉聚为一支，相似度为 99%，确定为 Pen Trichoderma sp.。

【参考文献】