基于代谢组学的灯盏花素对阿尔茨海默病模型小鼠的神经保护机制研究

发布时间：2020-08-04 10:18

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种病因和发病机制尚不明确的神经系统退行性疾病,主要临床表现为进行性记忆力减退、认知功能障碍及人格改变等症状。关于AD的发病机制尚没有统一的说法,普遍接受的观点是β-淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)的产生和清除失衡,导致大脑中Aβ过度沉积,促进AD的发病。目前临床使用的药物只能延缓AD病程的发展,缺乏理想的药物预防或治疗AD。因此,AD发病机制研究及其药物筛选成为广大研究者关注的热点。灯盏花素是灯盏细辛的总黄酮有效部位,长期用于治疗中风偏瘫和心绞痛。最新的研究发现其主要成分灯盏乙素可抑制Aβ的体外聚集,而且,对Aβ诱导的神经细胞毒性具有抵抗作用,说明灯盏花素可能有利于AD的治疗。经系统地文献检索,发现有关灯盏花素的神经保护机制的研究较少。本研究采用侧脑室注射Aβ1-42的方法建立AD小鼠模型,于模型建立的第二天给药。假手术组和AD模型组小鼠灌胃生理盐水,灯盏花素给药组小鼠灌胃低(35 mg/kg,Bre-L)、中(70 mg/kg,Bre-M)和高(140 mg/kg,Bre-H)剂量的灯盏花素,阳性药物组小鼠灌胃多奈哌齐溶液(剂量为1 mg/kg)。每天灌胃一次,直至实验结束。通过Morris水迷宫实验验证模型,采用HPLC-QTOF-MS代谢组学方法研究灯盏花素干预前后AD小鼠血浆中内源性物质的变化情况,鉴定潜在的生物标志物,从分子水平阐明灯盏花素对AD小鼠的神经保护作用机制。在Morris水迷宫实验中,定向航行实验表明,所有组别小鼠的逃避潜伏期随着训练次数的增加均有所减少,与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠找到安全平台需要更长的时间。与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在第4、6、7和8次训练中的逃避潜伏期显著延长(p0.01或p0.05),说明AD小鼠模型建立成功。另外,和AD模型组小鼠比较灯盏花素低、中、高三个剂量给药组小鼠及阳性药物组小鼠的逃避潜伏期都不同程度的缩短,灯盏花素高剂量给药组小鼠在第7次训练中以及阳性药物组小鼠在第8次训练中逃避潜伏期显著缩短(0.01)。在空间探索实验中,与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在目标象限的游泳路程占总路程的百分比显著降低(p0.01);另外,与AD模型组小鼠比较,灯盏花素中、高剂量给药组和阳性药物组小鼠在目标象限的游泳路程占总路程的百分比显著增加(p;0.05)。与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在目标象限的持续时间明显缩短(p0.01)。另外,与AD模型组小鼠比较,灯盏花素高剂量给药组和阳性药物组小鼠在目标象限的持续时间显著延长(p0.05)。综上,灯盏花素能够剂量依赖性改善AD小鼠的学习记忆能力。采用HPLC-QTOF-MS对小鼠血浆进行分析,正离子模式下采集的原始数据直接导入Profile analysis 2.0软件,聚类窗口的质量数设定为0.05 Da(m/z 50-1000),保留时间的范围设定为0.3 min(0-30min)。每个图谱中的所有离子进行离子强度的归一化处理,然后根据“80%规则”去除数据中的缺失值。软件自动生成用于多元统计分析的矩阵。该矩阵包含离子的保留时间、质荷比和离子强度信息。采用SIMCA-P 13.0软件对数据先进行主成分分析(PCA),然后经Par预处理后进行正交-偏最小二乘投影判别分析(OPLS-DA),筛选出10个潜在生物标志物。进一步用MS/MS对潜在的生物标志物进行分析,通过碰撞诱导解离(CID),碰撞能量分别为20 eV和40 eV,得到潜在生物标志物的子离子。通过与对照品的保留时间、精确质量和子离子数据比对或者检索在线数据库METLIN和HMDB,坚定了其中8个潜在生物标志物的化学结构。它们分别是3-吲哚丙烯酸、C16二氢神经鞘氨醇、溶血磷脂酰乙醇胺(22:6)、胆石酸3-O-硫酸酯、溶血磷脂酰胆碱(16:0)、磷脂酸(22:1/0:0)、牛磺脱氧胆酸和磷脂酰胆碱(0:0/18:0)。通过对以上8个生物标志物代谢途径的分析,本研究认为灯盏花素可能通过调节脂质代谢、提高机体5-羟色胺水平和降低体内胆固醇含量改善AD小鼠的学习记忆能力,发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

淀粉样前体蛋白,代谢途径

由单体聚合成低聚物，最终形成不溶性神经炎性斑块，对神经元功能的毒性作用逡逑显著，尤其损伤学习记忆能力。ＡＰ由ＡＰＰ经分泌酶水解而来，其在体内的代谢途径分为逡逑两种，如图１所示，一是经过ａ分泌酶分解，形成ｃｔ分泌片段和Ｃ８３蛋白，继而在丫分泌逡逑酶作用下，Ｃ８３蛋白分解为Ｐ３和位于细胞内且具有转录活性的ＡＰＰ片段（ＡＰＰ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑ｄｏｍａｉｎ，邋ＡＩＣＤ），这种途径不产生ＡＰ；二是经ｐ分泌酶分解为｜３分泌片段和Ｃ９９蛋白，同逡逑样再经Ｙ分泌酶作用，产生ＡＰ和ＡＩＣＤ［７］。所产生的ＡＰ片段有Ａｐｌ－４０和Ａｐｌ－４２两种，逡逑Ａｐｌ－４０是可溶性ＡＰ的主要形式，而Ａｐｉ－４２则是老年斑的主要成分，正常体内两者的比逡逑例大概是９：１，与ＡＰ１－４０比较，Ａｐｉ－４２更容易聚集，也具有更强的神经毒性［９］。逡逑在正常生理状态下，ＡＰ的生成和清除处于动态平衡，组织中ＡＰ的清除机制涉及酶逡逑的降解、受体介导的细胞清除和血管清除以及Ａ｜３在脑中的其他清除方式［１（）］。中性内肽酶逡逑

侧脑室注射,小鼠,位点

图２小鼠侧脑室注射位点逡逑Ｆｉｇ．２．邋Ｍｉｃｅ邋ｌａｔｅｒａｌ邋ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ逡逑验逡逑天进行Ｍｏｍｓ水迷宫实验。Ｍｏｒｒｉｓ水迷５０邋ｃｍ，全平直９邋ｃｍ）、

小鼠,路程,第四,探索实验

我们发现，在定向航行实验中，所有组别小鼠的逃避潜伏期随着训练次数的增加均逡逑有所减少，与假手术组小鼠（Ｓｈａｍ）相比，ＡＤ模型组小鼠（ＡＤ邋ｍｏｄｅｌ）找到安全平台需逡逑要更长的时间。如图４所示，与Ｓｈａｍ组小鼠比较，ＡＤ邋ｍｏｄｅｌ组小鼠在第４、６、７和８次逡逑训练中的逃避潜伏期显著延长（ｐ＜邋０．０１或ｐ＜邋０．０５），说明ＡＤ小鼠模型建立成功。另外，逡逑和ＡＤｍｏｄｅｌ组小鼠比较灯盏花素低（Ｂｒｅ－Ｌ）、中（Ｂｒｅ－Ｍ）、高（Ｂｒｅ－Ｈ）三个剂量给药组逡逑小鼠及阳性药物对照组小鼠（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）的逃避潜伏期都不同程度的缩短，Ｂｒｅ－Ｈ组小鼠逡逑在第７次训练中以及阳性药物组小鼠在第８次训练中逃避潜伏期显著缩短（ｐ＜邋０．０１）。逡逑１１１１１１）１１１１１１逡逑图４定向航行实验的逃避潜伏期逡逑Ｆｉｇ．４．邋Ｅｓｃａｐｅ邋ｌａｔｅｎｃｙ邋ｉｎ邋ｏｒｉｅｎｔｅｄ邋ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ邋ｔｅｓｔ．逡逑２．２空间探索实验逡逑在空间探索实验中，如图５所示，与Ｓｈａｍ组小鼠比较，ＡＤｍｏｄｅｌ组小鼠在第四象限逡逑的游泳路程占总路程的百分比显著降低（ｐ＜０．０１）。另外，与Ｍｏｄｅｌ组小鼠比较，Ｂｒｅ－Ｍ、逡逑Ｂｒｅ－Ｈ和Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ组小鼠在第四象限的路程占总路程的百分比显著增力□（尸＜邋0．0５）。如图逡逑６所示，与Ｓｈａｍ组小鼠比较，Ｍｏｄｅｌ组小鼠在第四象限的持续时间明显缩短（Ｐ＜0．0１）；逡逑另夕卜，与Ｍｏｄｅｌ组小鼠比较，Ｂｒｅ－Ｈ和Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ组小鼠在第四象限的持续时间显著延长（ｐ逡逑＜０．０５）。逡逑小鼠在空间探索实验中的运动轨迹如图７所示。与Ｓｈａｍ组小鼠比较

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