疏肝理脾方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肠道菌群的影响研究

发布时间：2020-08-04 21:57

【摘要】：目的:本研究从肠道微生态研究NASH“脾虚”病机实质,阐述“肝病实脾”理论论治NASH与肠粘膜稳态重建关系,探讨疏肝理脾方对NASH大鼠模型肠道菌群的影响。方法:实验选用健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只。适应性喂养1周,分为两组,其中一组随机选取8只大鼠作为正常组,给予正常饮食。其余52只大鼠,给予蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD饮食),MCD饮食的投放以10g/d/100g。8周后,正常饮食组(简称N)随机抽取2只大鼠,蛋氨酸胆碱缺乏饮食组随机选取4只大鼠对大鼠进行病理造模评价,并从两组中收集36个大鼠粪便样本。剩余48只大鼠被随机分为6组,分别为模型中药低剂量组(简称ML)、模型中药高剂量组(简称MH)、模型中药低剂量对照组(简称MLD)、模型中药高剂量对照组(简称MHD)、模型无中药组(简称M)、模型无中药对照组(简称MD)。ML组、MH组给予中药灌胃的同时MCD饮食。MLD与MHD照组给予中药同时予以正常饮食。M组为继续MCD饮食,MD组为给予正常饮食。中药低、高剂量分别给予0.92g/day,3.68g/day的中药灌胃。中药治疗4周,对大鼠进行大鼠粪便样本的收集。整个实验过程持续12周,期间保持各组大鼠进食量相同,平均每周测量各组大鼠的体重。结果1.一般情况比较8周时正常组大鼠毛发光泽顺滑,无脱毛现象,体重持续增加,大便粒大色黑。MCD饮食组大鼠毛发枯稿无光泽,毛发稀疏,体重持续降低,大便粒小色黄。12周时,MH组与MD组在体重、毛发、活动力等方面改善明显。MHD组与MD组比较,在体重、毛发、活动力等方面改善明显。2.肝脏组织HE染色MCD饮食组大鼠造模8周显示大鼠肝脏肝细胞组织不同程度出现程度的脂肪变性和变性,可见炎症细胞的浸润和局部小坏死灶。造模12周时,M组大鼠肝脏病理表现为肝细胞气球样变性,肝小叶边界模糊不清,肝细胞炎性浸润,肝细胞坏死,边界不清楚,可见肝纤维化。MHD组大鼠肝脏切片表现为肝脏脂肪沉积明显较造第8周时减轻,肝小叶结构边界尚清楚,未见明显炎症组织浸润。3.粪便肠道菌群16S rRNA高通量焦磷酸测序结果3.1物种组成分析所有样本都注释到了7个分类水平,并且在门水平上主要注释到了13个门,其中主要以厚壁杆菌、拟杆菌、放线杆菌、变性杆菌为主,并且MHD组与N组在门水平上肠道结构趋于相近。MH组与M组比较肠道菌群在门水平上也存在明显差异。在属水平上,N组和MHD组在属水平上丰度无明显差异。3.2大鼠肠道粪便样本的alpha多样性分析MLD组和MHD组、ML组和MH组在丰富度(chao1)和多样性(shannon)上比较二者无明显统计学意义(P0.05),表明中药剂量的高低对肠道菌群丰富度和多样性无明显影响。MHD组与MD组比较肠道菌群的丰富度和多样性,具有显著差异性,比较无显著统计学意义(P0.05)。且MHD组与正常组比较,二者无明显显著差异性。3.3大鼠肠道粪便样本的bate多样性分析N组与造模第8周时粪便肠道菌群比较表明两者肠道菌群结构差异性明显,两者比较具有统计学意义(P0.05)。ML组与MH组比较,MLD组与MHD组在距离上相差较远,肠道菌群结构上比较有明显差异(P0.05),MHD组与MD组比较肠道菌群结构具有显著差异(P0.05),MHD组与N组比较无明显差异性,二者具有显著性统计学意义(P0.05)。MH组与M组比较,二者在肠道菌群丰度和多样性方面具有显著差异(P0.05)。4.结论1.采用蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD饮食)成功的诱导产生的NASH大鼠模型,并且改变了肠道菌群的结构,损伤了肠道粘膜屏障。2.单纯低剂量中药干预对肠道菌群的丰度和多样性产生了影响,但是,并无统计学意义(P0.05)。高剂量中药干预对肠道菌群的丰度和多样性影响明显,能够在一定程度上恢复大鼠肠道菌群的丰度,降低肠道菌群的多样性,调节肠道稳态性。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

肝小叶边界清晰，未见炎症浸润。造模组 8 周时显组织不同程度出现程度的脂肪变性和变性，可见大量肝细胞常肝细胞明显增大，肝细胞内出现大量脂肪滴，并把细胞核戒征 。可见散在点状坏死灶，坏死区可见少量炎症细胞浸HE 染色比较明显差异（见图 2）。造模 12 周时，M 组大鼠肝脏组织脏病理表现为肝细胞气界模糊不清，肝细胞炎性浸润，肝细胞坏死，边界不清楚，组大鼠肝脏组织仍可见较多了肝细胞脂肪浸润，肝小叶结构浸润。MD 组大鼠肝细胞病理可见肝细胞脂肪浸润较 M 组明显正常，肝小叶结构边界尚清楚，未见明显炎症组织浸润。ML视野仍可见有肝细胞脂肪堆积，肝细胞体积稍大，偶可见少许组大鼠肝组织病理表现肝细胞脂肪堆积明显减少，肝小叶结胞的浸润。（见图 3）

MD 组大鼠肝细胞病理可见肝细胞脂肪浸润较 M 组明显减少，肝细胞正常，肝小叶结构边界尚清楚，未见明显炎症组织浸润。MLD 组大鼠肝组视野仍可见有肝细胞脂肪堆积，肝细胞体积稍大，偶可见少许炎症细胞浸润组大鼠肝组织病理表现肝细胞脂肪堆积明显减少，肝小叶结构正常，未见胞的浸润。（见图 3）图 1.正常肝脏外观（左）与造模 8 周时肝脏外观（右）对比图。

左）、MH 组（中）与 MHD 组（右）肝脏病理（*2A 高通量焦磷酸测序结果果处理主要采用 Illumina MiSeq 测序平台对本次研究中然后通过 barcode 拆分，最后获得其中的有效序了 3276796 条序列，测得的样本中最大的序列为，平均测到了 45511 条序列。通过使用 Qiime2 软，去除错误的序列、去除其中拼接的序列及嵌合列。所有样本得到的 OUT 为 1820111 条，样本中小为 18214 条，平均为 25276 条。（见图 4）

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本文编号：2781131