膝痹宁改善膝骨关节炎滑膜纤维化的机制探究

发布时间：2020-08-05 20:51

【摘要】：目的:探索膝痹宁治疗膝骨关节炎滑膜纤维化的效应机制;探明膝骨关节炎滑膜组织缺氧通过成纤维样滑膜细胞焦亡加剧滑膜纤维化的病理机制。方法:1、构建KOA大鼠模型,免疫荧光观察大鼠滑膜组织缺氧标记物哌莫硝唑,检测滑膜封组织缺氧诱导因子-1α的mRNA及蛋白表达水平;药物改善KOA大鼠滑膜组织的缺氧状况,膝关节横径、解剖学观察大鼠滑膜纤维化程度,HE和天狼星红染色切片观察滑膜纤维化的病理变化,检测滑膜组织纤维化标记物:TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA及蛋白表达水平。2、提取大鼠成纤维样滑膜细胞,LPS/ATP模拟KOA炎性环境并诱导细胞焦亡;siRNA转染沉默HIF-1α,检测启动细胞焦亡的核心:Caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD的mRNA及蛋白表达水平,ELISA检测细胞上清中IL-1β和IL-18的含量,流式细胞术检测细胞凋亡率。3、构建KOA缺氧细胞模型并用哌莫硝唑染色验证;siRNA转染沉默GSDMD并检测成纤维样滑膜细胞中TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA及蛋白表达水平。4、构建KOA大鼠模型,膝痹宁灌胃治疗后哌莫硝唑染色观察膝关节滑膜组织缺氧状况,检测HIF-1αα的mRNA及蛋白表达水平;Caspase-1(P10)、NLRP3、GS DMD的mRNA及蛋白表达水平;膝关节横径、解剖学观察大鼠滑膜纤维化程度,HE和天狼星红染色切片观察滑膜纤维化的病理变化,TGF-β、COL1A1、TIMP1的mRNA及蛋白表达水平。结果:1、哌莫硝唑染色显示KOA大鼠的滑膜组织比正常大鼠滑膜组织缺氧加重,HIF-1αα抑制剂地高辛(Digoxin,100 ug/kg)可抑制这种情况。KOA组滑膜组织中HIF-1α的基因和蛋白表达较正常组升高,差异有统计学意义(p0.05),KOA+Digoxin组对此有抑制作用(p0.05)。膝关节横径和解剖学观察均提示KOA大鼠的滑膜纤维化程度加重,KOA+Digo xin组有所改善:在HE染色中,KOA+Digoxin组滑膜衬里细胞排列整齐,结缔组织疏松,炎症细胞浸润少,在天狼星红染色下,KOA组胶原沉积增加,而KOA+Digoxin组胶原沉积量相对较少;PCR检测TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的基因表达,与正常组比较,KOA组表达量明显增加(p0.01),KOA+Digoxin组减弱这些基因的上调(p0.01)。WB检测上述纤维化标记物的蛋白表达发现了相同的变化趋势。2、在大鼠的成纤维样滑膜细胞中,Caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD的mRNA和蛋白表达在LP S/ATP组升高(p0.05,vs正常组),而在HIF-1α siRNA组降低(P0.05,vs LPS/ATP组)。ELISA法测定培养上清中IL-1β和IL-18含量,HIF-1α siRNA组低于LPS/ATP组(p0.05),高于正常组(p0.05)。流式细胞术显示,HIF-1α siRNA组细胞凋亡率明显高于正常组(p0.01),并且显著低于LPS/AIP组(p0.01)。3、Vehicle组和GSDMD siRNA组暴露于低氧(1%O2)24h后,哌莫硝唑染色显示两组细胞内存在相似的缺氧状态。然而,GSDMD siRNA组与Vehicle组相比,TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA和蛋白均表达下调,差异具有统计学意义(p0.05)。4、膝痹宁组滑膜组织缺氧较KOA组减轻;HIF-1α的mRNA和蛋白表达较KOA组降低,差异有统计学意义(p0.05);膝痹宁组Caspase-1(p10)、NLRP3、GSDMD的mRNA及蛋白表达水平低于KOA组(p0.05);解剖学观察提示膝痹宁组滑膜纤维化程度减轻;膝痹宁组用药42天,56天时,膝关节横径较KOA组减小(p0.05);HE染色和天狼星红染色观察到膝痹宁组滑膜衬里细胞排列整齐,结缔组织疏松,炎症细胞浸润较少,胶原沉积量较少;膝痹宁组TGF-β、COL1A1、TIMP1的mRNA及蛋白表达水平低于KOA组(p0.05)。结论:1、KOA中,滑膜组织处于缺氧状态并引起HIF-1α的升高;2、KOA中,升高的HIF-1α诱导成纤维样滑膜细胞焦亡;3、KOA中,成纤维样滑膜细胞焦亡会加剧滑膜纤维化的病程进展;4、膝痹宁口服改善膝关节滑膜组织缺氧状态,降低HIF-1α的表达,并有可能通过抑制细胞焦亡减轻滑膜纤维化。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

第二章实验研究逡逑ＫＯＡ组滑膜组织中ＨｌＦ－ｌａ的基因（图２）和蛋白（图３）表达较正常组升高，差统计学意义（＊ｐ＜0．0５），Ｋ0Ａ＋Ｄｉｇｏｘｉｎ组滑膜组织中ＨＩＦ－ｌａ的基因和蛋白表达较Ｋ组降低，差异有统计学意义（＃ｐ＜邋０．０５）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ逦ＫＯＡ逦ＫＯＡ邋＋邋Ｄｉｇｏｘｉｎ逡逑

各组大鼠右膝关节横径的变化情况

逦ＫＯＡ邋＋邋Ｄｉｇｏｘｉｎ逡逑图３：各组大鼠滑膜组织ＨＩＦ－ｌａ的ｍＲＮＡ表达逡逑膝关节横径（图４）和解剖学观察（图５）均提示ＫＯＡ大鼠的滑膜纤维化程度加重，逡逑ＫＯＡ＋Ｄｉｇｏｘｉｎ邋组有所改善（＃ｐ邋＜０．０５，ｖｓＫＯＡ组）。逡逑２６逡逑

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本文编号：2781860