东北林蛙卵胶膜中多糖的提

发布时间：2020-08-06 15:30

【摘要】：东北林蛙(Rana dybowskii),以其多种生物活性功能引起国内外学者的广泛重视与研究。而东北林蛙的卵胶膜对于林蛙卵的孵化也具有重要作用,它有调节钙离子浓度的作用,使卵在卵胶膜中达到最佳受精状态,抵御环境变化的能力,可以确保受精卵能够维持正常的渗透压,防止病菌侵入,为受精卵提供营养供应。不同种两栖类的卵胶膜形态和层数不一,它们的化学成分也各不相同,东北林蛙卵胶膜中主要为粘多糖和蛋白质等。本文以雌性东北林蛙排卵后1小时内的林蛙卵胶膜为原材料对其部分生物活性物质进行深入研究。由于林蛙极高的营养价值与药用价值,一直以来都非常被学者们重视,对其主要产品如林蛙油、林蛙卵、林蛙卵油以及林蛙肉等的主要营养成分都有广泛的研究,而对于林蛙卵胶膜中的常规营养组分含量的测定却未见报道,所以本文测定了不同产地不同蛙龄的林蛙所产卵胶膜中水分、灰分、脂肪、蛋白质的含量。水分含量的测定采用直接干燥法,总灰分和酸不溶性灰分含量的测定采用重量法,脂肪含量采用索氏抽提法测定,蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定。经过实验测定林蛙卵胶膜中卵胶膜水分含量在72%-79%之间,总灰分含量在0.59%-0.94%之间,酸不溶性灰分含量在0.06%-0.14%之间,脂肪含量在1.6%-3.5%之间,蛋白质含量在147-175mg/g之间。本文建立了林蛙卵胶膜中水解氨基酸的检测方法,衍生化试剂选用异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate),衍生方式为柱前衍生,采用高效液相色谱仪同时测定水解氨基酸种类及含量,此方法可以方便、快捷、准确的检测林蛙卵胶膜中水解氨基酸。同时,比较了吉林省内不同产地,不同蛙龄林蛙所产卵胶膜中所含氨基酸的种类与各氨基酸含量的差异。除色氨酸外,其他氨基酸均有检出,氨基酸含量最高达到10.004mg/g,其必需氨基酸占比达到24.57%。采用木瓜蛋白酶酶解法提取林蛙卵胶膜中的多糖,并用响应面分析法优化东北林蛙卵胶膜中多糖的提取工艺。以加酶量、pH值、提取温度、提取时间为变量,探讨四个主要变量对多糖提取率的影响及其之间相互作用的关系,并对提取工艺进行优化。通过单因素实验结果和响应曲面的模型预测,结合实际实验条件得到的最佳提取工艺为:加酶量74.55mg/g,pH值7.67,温度52.55℃,提取时间2.09h,按此条件进行提取,多糖的提取率为23.84±0.07 mg/g。采用上述方法提取出的卵胶膜粗多糖除去蛋白质及透析除去小分子杂质后,首先用DEAE-52纤维素进行离子交换柱层析,得到精多糖I和精多糖II两个组分,收集大的洗脱峰组份精多糖I,进行萄聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析,得到一单一组分,将该组分真空冷冻干燥得到林蛙卵胶膜精制多糖I 138.6mg。对精多糖I进行多糖类物质基本理化性质测定,为白色絮状固体,易溶于热水,不易溶于冷水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂,颜色反应证明具有多糖类化合物的通性;利用红外光谱法(IR)确定其单糖构型并通过气相色谱法确定其单糖组成。不含有核酸和蛋白质等杂质,主要由甘露糖(MAN)、葡萄糖(GLU)和半乳糖(GAL)组成,各单糖质量百分数占比分别为30.72%、29.13%、32.47%。林蛙卵胶膜精多糖I的吸湿保湿性及体外抗氧化性进行测定,以甘油、透明质酸和聚乙二醇(PEG-400)三种常用保湿剂作对照,在24h之内,对卵胶膜精多糖I的吸湿性能力和保湿能力进行测定。以抗坏血酸为对照,对卵胶膜精多糖I的抗氧化性进行测定。结果表明,卵胶膜精多糖I具有一定的吸湿保湿能力,24h内卵胶膜精多糖I与三种保湿剂综合吸湿能力比较为:甘油透明质酸卵胶膜精多糖IPEG-400,卵胶膜精多糖I与三种常用保湿剂的保湿能力对比为:透明质酸甘油卵胶膜精多糖IPEG-400;RH81%条件下,24h内卵胶膜精多糖I最大吸湿率为11.41%,RH43%条件下,24h内卵胶膜精多糖I最大吸湿率达到4.96%,在24h的干燥硅胶条件下,卵胶膜精多糖I的保湿率达到40.47%。以抗氧化剂抗坏血酸为阳性对照,林蛙卵胶膜精多糖I表现出具有一定的还原能力,对羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)均有不同能力的清除效果,且随着多糖浓度的增加,其对自由基的清除能力也成线性增长趋势,当多糖浓度为2mg/mL时·OH清除率为30.43%,O2-·清除率为85.59%,DPPH·清除率为69.80%。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
【图文】：

胶膜,不同产地,含量比较,中水

图 1.1 不同产地与蛙龄的林蛙卵胶膜中水分含量比较Fig.1.1Compare of Moisture content in Rana Dybowskii Jelly Coats.3.2东北林蛙卵胶膜中灰分含量采用药典方法对靖宇、敦化、蛟河、抚松、桦甸五个不同产地的二龄蛙与三龄蛙卵胶灰分含量进行测定，测定结果见表，由表可知，五个产地不同蛙龄的卵胶膜中东北林蛙膜中总灰分与酸不溶性灰分含量有差异，灰分含量在 0.59%-0.94%之间，酸不溶性灰分.06%-0.14%之间，其中蛟河蛙卵胶膜中灰分和酸不溶性灰分含量高于其他产地，三龄蛙膜中灰分和酸不溶性灰分略高于二龄蛙卵胶膜。总灰分含量最高蛟河三龄蛙卵胶膜为 00.01%，含量最低为抚松二龄蛙卵胶膜 0.59±0.02%，酸不溶性灰分含量最高为蛟河三卵胶膜 0.14±0.01%，含量最低为抚松二龄蛙卵胶膜 0.06±0.00%。表 1-6 不同产地和蛙龄的林蛙卵胶膜中灰分含量Tab. 1-6 Result of Ash Content in Rana Dybowskii Jelly Coats产地灰分含量(%) 酸不溶性灰分含量（%）二龄三龄二龄三龄

胶膜,含量比较,不同产地,中灰

图 1.2 不同产地与蛙龄的林蛙卵胶膜中灰分含量比较Fig.1.2 Compare of Ash content in Rana Dybowskii Jelly Coats图 1.3 不同产地与蛙龄的林蛙卵胶膜中酸不溶性灰分含量比较

酸不溶性灰分,胶膜,不同产地,含量比较

15图 1.3 不同产地与蛙龄的林蛙卵胶膜中酸不溶性灰分含量比较Fig.1.3 Compare of Acid-insoluble Ash content in Rana Dybowskii Jelly Coats.3 东北林蛙卵胶膜中粗脂肪含量采用药典方法对靖宇、敦化、蛟河、抚松、桦甸五个不同产地的二龄蛙与三龄蛙卵肪含量进行测定，测定结果见表 1-7，由表可知，五个产地不同蛙龄的东北林蛙卵肪含量存在差异，含量在 1.6%-3.5%之间，三龄蛙卵胶膜脂肪含量同样高于二龄蛙蛟河三龄蛙卵胶膜中脂肪含量最高为 3.49±0.06%，桦甸二龄蛙卵胶膜中脂肪含量1.58±0.11%。

【参考文献】