桦褐孔菌中主要三萜类成分的高效提取分离新工艺

发布时间：2020-08-07 11:18

【摘要】：桦褐孔菌(Ionotus obliquus)是一种天然的药用真菌,已经被广泛研究开发并应用于药品和食品的研究中。该药用真菌中化学成分类型丰富,如三萜、甾类、多酚、多糖等,其中三萜类成分具有极其显著的抗肿瘤等药理活性。目前,国内外对桦褐孔菌中三萜成分提取分离工艺的文献报道较少,均采用传统的有机溶剂提取与柱层析分离获得三萜化合物单体,存在操作繁琐、费时费力等缺点。本实验率先采用酶诱导结合负压空化提取技术对桦褐孔菌中的三萜化合物进行了高效的提取,并利用大孔吸附树脂对桦褐孔菌中的三萜化合物进行了有效的富集,最后利用高速逆流色谱对三萜化合物单体成分进行了分离纯化,得到4种三萜化合物单体。本研究系统地建立了一套对桦褐孔菌中三萜化合物的高效提取分离新工艺,为桦褐孔菌资源的深度开发利用提供了科学基础,并具有重要的应用潜力。本论文的研究结果如下:1.采用单因素实验和Box-Behnken(BBD)实验设计对酶诱导结合负压空化方法提取桦褐孔菌中三萜化合物的工艺参数进行考察以及优化,确定最优的提取工艺参数:酶种类:纤维素酶酶浓度:1 mg/mL诱导温度:40℃诱导时间:24 h在最佳酶诱导条件下进行了实验,诱导后的桦褐孔菌粉末中三萜化合物的含量为16.35 mg/g,比未经酶诱导的桦褐孔菌中三萜化合物的含量提高了 28.13%。提取溶剂:75%乙醇溶液提取压力:-0.08 Mpa液固比:16提取温度:43℃提取时间:30 min在上述优化条件下进行了实验,对经酶诱导得到的桦褐孔菌粉末进行了提取,三萜化合物的提取率为17.41mg/g(n=3),相对标准偏差(RSD)是0.85%。2.采用大孔吸附树脂对桦褐孔菌粗提物中的三萜化合物进行富集纯化,确定了最优的工艺条件:树脂类型:AB-8样晶体积:8/3 BV样品浓度:1 mg/mL上样流速:1 BV/h除杂解吸液浓度:60%乙醇溶液除杂解吸液体积:3 BV洗脱解吸液浓度:90%乙醇溶液洗脱解吸液体积:4.5 BV在上述优化条件下,得到三萜化合物的回收率为85.92%,含量达53.26%,是富集前的4.67倍。3.利用高速逆流色谱对桦褐孔菌中三萜化合物进行分离,优化得到了最优条件参数:分离溶剂体系:正己烷-乙腈(1:1;v/v)固定相:上相流动相:下相温度:25 ℃主机转速:800 rpm流动相流速:1 mL/min在上述优化条件下,经过一次等梯度的分离,在5小时内得到4个化合物,包括3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇,得率分别为0.10 mg/g、0.13 mg/g、0.35 mg/g、0.17 mg/g,回收率分别为 93.1%、95.2%、97.8%、98.1%,纯度均在95%以上。综上所述,本论文利用酶诱导结合负压空化提取三萜化合物的得率为17.41mg/g,大孔吸附树脂富集三萜化合物含量为53.26%,并利用高速逆流色谱分离得到3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇四种三萜化合物单体。本研究获得了一种高效、快速、可靠的桦褐孔菌中三萜化合物的提取、富集以及分离纯化的新工艺,同时为其他植物资源中的次生代谢产物的制备利用提供了有效的技术支撑。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284
【图文】：

曲线,三萜,含量测定,曲线

２．２．１标准曲线的绘制逡逑利用标准品的浓度绘制横坐标，对应的溶液的吸光度绘制纵坐标，得到总三萜含量逡逑测定的标准曲线，见图２－２。逡逑ｙ邋＝邋０－．７４５邋ｌｘ邋－邋０．０５２逡逑１６邋．逦Ｒｉ邋＝邋０．９９９１逡逑１．４逡逑ｍ邋ｉ邋■逡逑＆邋０－８逡逑０．６逡逑０．４逡逑０＊２邋－逡逑Ｑ邋＾逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦｜逡逑０逦ＯＳ逦１逦１．５逦２逦２．５逡逑浓度（ｍｇ／ｍＬ〉逡逑图２－２总三萜含量测定的标准曲线逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｃｏｎｔｅｎｔ逡逑该标准曲线的回归方程为ｙ邋＝邋０．７４５１ｘ邋＋邋０．０５２，邋Ｒ２邋＝邋０．９９９１，说明在０－ｌｍｇ的范围中，逡逑三萜化合物和其吸光度值线性关系良好。逡逑２．２．２提取工艺条件的单因素优化逡逑２．２．２．１不同种类的酶诱导对桦褐孔菌提取物中三萜含量的影响逡逑－１４－逡逑

纤维素酶,酶诱导,提取物,葡萄糖苷酶

逑桦褐孔菌经相同浓度的纤维素酶、Ｐ■葡萄糖苷酶和果胶酶的处理后，对提取物中逡逑三萜化合物含量进行了检测，并与未经酶处理的提取物进行了对比，结果见图２－３。可逡逑以看出，经过酶处理的提取物中三萜化合物含量都高于对照组含量，并且经纤维素酶和逡逑Ｐ－葡萄糖苷酶处理所得提取物的三萜含量明显高于经果胶酶处理的含量。可能原因是在逡逑处理过程中，酶作用于细胞壁，使细胞壁遭到破坏，化学成分可以更高效地溶出。综合逡逑对经济成本的影响，纤维素酶较为低廉，被应用于对桦褐孔菌材料进行酶诱导处理。逡逑１６邋ｒ逡逑１４邋ｐｉ－逦ｒ＾￣ｉ逦Ｔ逡逑－１２逡逑Ｍｌ逡逑＇Ｓｏ邋ｌ0逡逑ａ逡逑＾邋８逡逑Ｍ邋＾逡逑＆邋６邋■逡逑？邋４邋－逡逑！逡逑２邋－逡逑ｑ邋逦ｊ逦：逦ｉ逦；逦ｉ逦！逦Ｉ逦ｉ逦：逦ｉ逡逑纤维羞南逦ｐ－葡萄耱苷南逦果胶病逦对照逡逑南神类逡逑图２－３不同种类的酶对桦褐孔菌三萜化合物含量的影响逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｋｉｎｄｓ邋ｏｆ邋ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｆｒｏｍ邋／．邋ｏｂｌｉｑｕｕｓ逡逑２．２．２．２酶诱导浓度对桦褐孔菌提取物中三萜含量的影响逡逑在选择酶的种类后，对处理桦褐孔菌材料的纤维素酶的浓度进行了考察，不同浓度逡逑的酶的影响结果见图２－４。可以看出，随着浓度的增加，桦褐孔菌中三萜化合物的含量逡逑也逐渐增加，至浓度为１邋ｍｇ／ｍＬ时，含量达到了最大值，增加了邋１１．５３％；随着酶浓度逡逑的继续增加，三萜化合物的含量也有所降低。可能原因是过多的酶会在植物组织中发生逡逑了其他的反应。因此

示意图,高速逆流色谱,仪器,分离仪

ａ＝Ｋ２／Ｋｉ邋（Ｋ２＞Ｋ，）逡逑４．１．４分离实验过程逡逑高速逆流色谱分离仪器如图４－１所示。逡逑ｍ邋ｐ邋ｗ邋ｌｌｌｌ邋Ｌ－ＪＪ邋￣Ｗｉ邋＼邋ａ逡逑＿＾逦｜ｆｔｌ逦口逦Ｉ－逡逑Ｎ逦逡逑图４－ｌ高速逆流色谱仪器示意图逡逑Ｆｉｇ．４－ｌ邋Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＨＳＣＣＣ逡逑－３１－逡逑

【参考文献】