【摘要】：背景目的:以往研究证实肝纤维是可逆的,而目前尚缺少逆转肝纤维化特效又安全的药物。本研究通过复制血瘀型肝纤维化大鼠模型,观察莪术醇对血瘀型肝纤维化大鼠的治疗效果,并明晰莪术醇对体内外肝窦内皮细胞(LSEC)超微结构的影响,探讨莪术醇抗肝纤维化的作用机制。方法:(1)血瘀证肝纤维化大鼠模型的复制及大鼠原代LSEC的分离、培养及鉴定:(1)血瘀证肝纤维化大鼠模型的复制:“去甲肾上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”复制血瘀型肝纤维化大鼠模型。前3周以40%CCl4花生油混合液,0.3 mL/100g剂量,皮下注射给大鼠,每周2次,第4周开始以50%CCl4花生油混合液同样方法予大鼠,共8周。从第2周开始,予大鼠尾静脉注射0.1 g/L去甲肾上腺素,1次/日,连续给药3周。并于模型复制开始的第1天及第10天,予大鼠尾静脉注射50 g/L小牛血清白蛋白。外加10%乙醇予大鼠灌胃。通过自拟血瘀证证候评分表观察血瘀证复制情况,HE染色和Masson染色观察肝组织纤维化病变,全自动生化分析仪检测大鼠血清肝功能及肝纤维化四项(HA、LN、PⅢNP、Col-Ⅳ)水平,综合观察模型复制情况。(2)大鼠原代LSEC的分离、培养及鉴定:通过肝脏胶原酶灌注结合Percoll密度梯度沉降法及细胞选择性贴壁法,分离LSEC。扫描电镜及di-Ac-LDL免疫荧光染色,鉴定分离培养的LSEC。(2)莪术醇治疗血瘀证肝纤维化的体内实验研究:实验分为6组,即正常对照组、血瘀型肝纤维化模型组、秋水仙碱组、丹参酚酸B组、莪术醇低剂量组、莪术醇高剂量组。采用“去甲肾上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”复制血瘀型肝纤维化大鼠模型成功后,予各药物治疗,实验结束后,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定ET-1蛋白的表达,扫描电镜及透射电镜观察肝组织LSEC超微结构改变,并测定肝指数、血瘀证证候积分、病理检查(HE染色和Masson染色)、血清肝功能及肝纤维化四项水平,明晰莪术醇对血瘀型肝纤维化的作用。(3)莪术醇改善LSEC超微结构病变的体外实验研究:通过瘦素诱导激活LSEC后,予不同浓度的莪术醇治疗,扫描电镜及透射电镜观察LSEC超微结构变化,了解莪术醇对瘦素诱导激活的LSEC的影响。结果:(1)血瘀证肝纤维化大鼠模型的复制及大鼠原代LSEC的分离、培养及鉴定结果:(1)血瘀证肝纤维化大鼠模型的复制结果显示,采用“去甲肾上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”复制的血瘀证肝纤维化大鼠模型大鼠毛发稀疏、枯燥,舌面暗红,甚至青紫有瘀斑,舌底静脉曲张,尾部有瘀斑,血瘀证证候明显,血瘀证证候积分显著高于花生油对照组(P0.01)。肝脏肿大,表面暗紫有细小颗粒,内部有小结节。HE染色和Masson染色观察模型大鼠肝组织有明显纤维化病变。模型大鼠肝指数、血清肝功能ALT、AST及肝纤维化四项水平高于花生油对照组(P0.05或P0.01)。(2)大鼠原代LSEC的分离、培养及鉴定结果显示,采用肝脏胶原酶灌注结合Percoll密度梯度沉降法及细胞选择性贴壁法,分离培养的LSEC生长良好,形态典型,生长有规律,从圆形、卵圆形到纺锤形生长转变。扫描电镜观察到分离的LSEC表面具有独特的窗孔结构,多个窗孔排列成筛板样结构,di-Ac-LDL免疫荧光染色显示分离培养的LSEC纯度较高。(2)莪术醇治疗血瘀证肝纤维化的体内实验研究结果显示,莪术醇能降低模型大鼠血瘀证证候积分、肝指数、血清肝功能ALT、AST及肝纤维化四项水平(P0.05或P0.01)。HE和Masson染色病理结果显示,经莪术醇治疗后,模型大鼠肝纤维损伤明显改善;肝纤维化程度半定量分析结果显示,莪术醇组肝纤维化程度较模型组显著减轻(P0.05)。扫描电镜及透射电镜结果显示,莪术醇能使模型大鼠LSEC窗孔数量增多,连续性基底膜消失。ELISA结果显示,模型组ET-1蛋白表达较正常对照组明显升高(P0.01),莪术醇能下调ET-1蛋白表达(P0.01)。莪术醇治疗血瘀证肝纤维化的疗效和阳性对照药物秋水仙碱和丹参酚酸B疗效相近,但莪术醇和丹参酚酸B改善血瘀证证候体征比秋水仙碱明显,莪术醇增加肝组织LSEC窗孔数量和直径比丹参酚酸B和秋水仙碱效果显著。(3)莪术醇改善LSEC超微结构病变的体外实验研究结果显示,扫描电镜及透射电镜观察到经瘦素诱导激活的LSEC,其窗孔数量大幅减少甚至消失,窗孔直径变小,出现“失窗孔化”现象。经莪术醇治疗后,与瘦素激活模型组比较,其窗孔数量明显增多,窗孔变大。结论:莪术醇能明显改善血瘀型肝纤维化病变,其机制可能与下调ET-1蛋白表达及逆转肝窦毛细血管化有关。莪术醇在体内外实验中均能减轻LSEC“失窗孔化”等超微结构改变。这将为肝纤维化的防治提供重要参考价值。
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：
各组大鼠肝指数（%）
血瘀证模型组血瘀证体征表1-4大鼠血瘀证证候级别评分结果（±s，n=10）
大鼠血瘀证证候级别评分结果
【参考文献】
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本文编号：
2788975
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