质谱及微流控芯片分析技术在中药质量评价中的应用研究

发布时间：2020-08-11 13:32

【摘要】：推进药品质量控制技术的创新发展是实现中药现代化和国际化的关键,对于保障中药产品的安全性、有效性和一致性具有重要意义。经过多年努力,中药质量控制技术已取得巨大进步,尤其是中药质量评价技术发展迅速,形成了以化学检测为核心的中药质检技术体系。然而,中药质量评价技术领域依然面临着众多难题,如检测方法性能不佳、检测成本较高、与临床疗效相关性较低等,制约了中药产品标准的进一步提升。中药化学组成复杂且药效成分往往未知,测定一个或少数几个指标性成分难以真实反映大部分中药产品的质量,这导致了化学检测方法往往脱节于中药的药效和临床疗效。由于生物活性与药品疗效具有更直接的联系,近年来生物活性检测已成为中药质量评价技术的前沿研究方向。因此,如何突破化学检测与中药药效脱节的难关,将生物活性检测与化学检测相融合,建立符合中药特点的质量评价方法已成为现代中药研究中的关键科技问题。生物标志物是当今生命科学领域的一大研究热点,在新药研发、疾病诊断和治疗等方面都表现出巨大应用前景。生物标志物研究中涌现的研究策略及检测方法为中药质量评价提供了崭新理念和技术创新源泉,有望成为提升中药质量控制技术水平的重要路径。据此,本文围绕上述关键科技问题,针对现有中药质量评价方法存在的缺陷和不足,在中药生物活性检测、化学检测以及化学-生物融合检测三个方面开展创新研究,提出了基于微流控芯片的中药生物活性评价方法、基于衍生多反应监测指纹图谱的中药化学成分一致性评价方法,并构思设计质谱响应探针,在实时直接分析质谱(DART-MS)上实现化学-生物融合检测。本文主要研究内容及其学术贡献如下:1.为解决中药生物活性检测方法指标单一、分析成本高、样品消耗大等问题,以芪参益气滴丸为研究对象,提出一种基于微流控芯片的中药生物活性评价方法,首次将微流控芯片应用于中药质量评价。本研究针对芪参益气滴丸的两个关键靶酶——凝血酶与血管紧张素转化酶(ACE),设计研制了多功能的微流控芯片。将其用于不同批次样品的生物活性评价,实现了正常与异常批次样品的识别,并同时筛选出具有酶抑制活性的化合物。2.为解决色谱指纹图谱耐用性差等问题,提出一种基于衍生多反应监测(MRM)的指纹图谱分析方法用于中药成分一致性评价。通过衍生MRM将四极杆飞行时间质谱(QTOF-MS)的MS2质谱参数转化为三重四级杆质谱(QqQ-MS)的MRM质谱参数,无需对照品即可获取MRM,从而建立中药化学成分指纹图谱,具有效率高、专属性强、灵敏度高等优点。将其用于芪参益气滴丸化学成分一致性评价,研究结果表明基于衍生MRM的指纹图谱具有良好的耐用性,并可准确区分正常与异常批次的样品。3.为探索创建中药生物活性多重检测(同时检测多个生物指标)以及化学-生物融合检测(在一个分析平台同步完成生物活性检测和化学检测)方法,本研究以丹参注射液为研究载体,从检测原理层面进行创新设计,提出一种基于质谱响应探针的中药质量评价方法,破解了化学-生物融合检测难题。在能够特异性识别生物靶标的肽段上修饰易于离子化的标签分子,从而合成得到质谱响应探针,用于多靶标高灵敏同步检测;进而通过DART-MS实现中药质谱指纹图谱与多靶酶活性的融合检测,可快速、灵敏、准确地评价丹参注射液化学成分一致性与生物活性。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;O657.63
【图文】：

生物标志物,新药开发,生物标志物检测,微流控芯片

药效生物标志物（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）以及替代终点（ｓｕｒｒｏｇａｔｅｅｎｄｐｏｉｎｔｓ／逡逑ｅｆｆｉｃａｃｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ邋）等［８３］。这些生物标志物在在新药开发不同阶段的作用逡逑及示例如图１．１所示。逡逑如何从复杂的生物样品中找出潜在的生物标志物，如何准确测定复杂基质中逡逑微量、痕量的生物标志物，如何快速、即时地检测生物标志物以满足临床需求，这逡逑些研究和应用都离不开检测技术的支持。生物标志物检测技术在标志物发现、筛选、逡逑验证和应用等过程中均扮演着重要角色。由于生物标志物涵盖的范围非常广泛，其逡逑检测技术也是多种多样，几乎所有基因、蛋白、小分子代谢物、糖类、脂类的分析逡逑技术都可用于生物标志物检测，包括基因／蛋白芯片、微流控芯片、质谱、色谱、逡逑核磁共振、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）等。在生物标志物研究中涌现的许多高通量、逡逑高内涵、低损耗检测技术和方法对中药质量评价方法开发具有重要的借鉴意义。因逡逑此，本节对生物标志物检测中两个常用的技术——微流控芯片和质谱进行介绍，并逡逑简述其在生物标志物检测中的应用。逡逑１．３．１微流控芯片在生物标志物检测中的应用概况逡逑微流控芯片（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ），又称微全分析系统（ｊｉ－ＴＡＳ）或芯片实验室逡逑（ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）

方法研究,临床疗效,成分含量,生物标志物

析化学、药物分析学、药物信息学和大数据科学等对中药生物标志物和化学标志物逡逑开展系统研究，推进相关技术的集群创新和成果共享，实现中药质量评价方法研究逡逑的标准化和高效化。生物方法研究平台如图１．２所示，与生物标志物研究类似，我逡逑们将中药质量评价方法的研究分为标志物发现、确证和应用三个阶段：逡逑①

质谱,化学检测,生物指标,论文研究

图１．３论文研究框架逡逑针对中药生物活性检测研究中多重检测（同时检测多个生物指标）及化学－生物融逡逑合检测（在一个分析平台同步完成生物活性检测和化学检测）两个关键技术问题，逡逑本章提出了一种基于质谱响应探针和实时直接分析质谱（ＤＡＲＴ－ＭＳ）的中药质量逡逑评价方法。通过设计并合成一类崭新的质谱响应探针，显著提高了酶特异性底物的逡逑质谱响应，实现多个靶酶的高灵敏度、高选择性检测。在此基础上，采用ＤＡＲＴ－逡逑１７逡逑

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