枫寥肠胃康对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠动力及氯离子分泌的影响

发布时间：2020-08-12 11:29

【摘要】：目的观察枫蓼肠胃康颗粒对腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)的治疗作用并从离体结肠平滑肌收缩及结肠黏膜氯离子分泌探讨及其疗效机制。方法本研究分为以下四个实验:一、枫蓼肠胃康颗粒对IBS-D大鼠的治疗作用;二、枫蓼肠胃康颗粒对正常大鼠结肠平滑肌肌条收缩的影响及机制探讨;三、枫蓼肠胃康颗粒对IBS-D大鼠结肠平滑肌肌条收缩的影响及机制探讨;四、枫蓼肠胃康颗粒对IBS-D大鼠结肠粘膜氯离子分泌的影响及机制探讨。具体方法如下:实验一:1 日龄无特定病原体级(SpecificpathogenFree,SPF)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠随机分为6组,包括正常组、模型组、枫蓼肠胃康高剂量组、枫蓼肠胃康中剂量组、枫蓼肠胃康低剂量组、阳性对照药组(匹维溴铵组)。正常组不予任何处理,其余各组采用母婴分离联合束缚应激方法建立IBS-D大鼠模型。60日龄造模结束并进行模型评价。以粪便情况(粪便颗粒数、粪便含水量),内脏敏感性(结直肠球囊扩张刺激时腹外斜肌肌电曲线下面积比值(areaunderthecurve,AUC(%))的变化及腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)评分变化)为模型评价指标。造模成功后,各组大鼠给予相应干预措施:枫蓼肠胃康高、中、低剂量组每天每100克大鼠体重分别给予枫蓼肠胃康生药量0.47克、0.95克、1.89克;匹维溴铵组每天每100克大鼠体重给予2.1毫克匹维溴铵;各组均通过灌胃给药的方式,药物组每100克大鼠体重给药1毫升,正常组和模型组给予等量的生理盐水,连续灌胃14天。灌胃结束后,以粪便情况(粪便颗粒数、粪便含水量)和内脏敏感性(AWR评分变化和AUC(%))评价枫蓼肠胃康颗粒对IBS-D模型大鼠的治疗作用。实验二:以SPF级雄性SD大鼠(体重:250-300g)制备正常大鼠离体纵行结肠平滑肌肌条(coloniclongitudinalsmoothmusclestrips,CLSMSs),以通有混合气体(95%O2和5%C02)的Krebs液为CLSMSs的外营养液,以无辅料的枫蓼肠胃康干膏和Krebs液制备不同浓度的枫蓼肠胃康溶液,通过离体组织灌流系统进行观察对比:1.以生理盐水作为对照,观察枫蓼肠胃康对基础状态下CLSMSs收缩的影响;2.以生理盐水作为对照,观察枫蓼肠胃康对不同刺激引起CLSMSs收缩的影响。3.以自身前后作为对照,探讨枫蓼肠胃康抑制乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的机制。实验三:将1日龄SPF级SD雄性大鼠分为三组:模型组、正常组、枫蓼肠胃康组,参照实验一的方法造模与给药,灌胃结束后,制备各组大鼠的CLSMSs,并通过离体组织灌流系统研究对比:1.观察枫蓼肠胃康对基础状态下CLSMSs收缩的影响;2.观察枫蓼肠胃康对乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的影响;3.枫蓼肠胃康抑制乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的机制探讨。实验四:参照实验三中的分组、造模与给药方法,制备剥除粘膜下层、肌层和浆膜层后的离体结肠粘膜标本,并通过体外短路电流技术观察对比:1.观察枫蓼肠胃康对基础状态下跨上皮电压、短路电流及跨上皮电阻的影响;2.观察枫蓼肠胃康对毛喉素引起短路电流的变化(short-circuit current,AIsc)的影响;3.氯离子离子替代后观察枫蓼肠胃康对毛喉素引起AIsc的影响;4.枫蓼肠胃康抑制结肠黏膜氯离子分泌的机制探讨。结果实验一:1.IBS-D大鼠模型评价:(1)排便频率和粪便含水量增加:母婴分离结合束缚应激结束后,与正常组大鼠相比,模型组大鼠粪便颗粒数增多(P0.01)、粪便含水量增高(P0.01);(2)内脏敏感性增高:AUC(%)及AWR评分高于正常组(结直肠内球囊压力在40、60毫米汞柱时(P0.01)、80毫米汞柱时(P0.05))。2.枫蓼肠胃康颗粒对IBS-D模型大鼠的治疗作用:(1)改善粪便情况:①降低粪便含水量:与模型组比较,枫蓼肠胃康高剂量组、中剂量组粪便含水量均降低(P0.01)。②减少排便频率:与模型组比较,枫蓼肠胃康中剂量组的粪便颗粒数减少(P0.05)。(2)改善内脏高敏感性:①降低AUR(%):与模型组相比,枫蓼肠胃康高、中剂量组AUR(%)均降低(在结直肠扩张压力为40、80 mmHg时枫蓼肠胃康高、中剂量组(P0.01);在结直肠扩张压力为60mmHg时枫蓼肠胃康高剂量组(P0.01),中剂量组(P0.05))。②降低AWR评分:与模型组相比,枫蓼肠胃康高、中剂量组AWR评分均降低(在结直肠扩张压力为40、60、80 mmHg时(P0.05))。实验二:1.枫蓼肠胃康可抑制基础状态下CLSMSs收缩:与对照组相比,从枫蓼肠胃康累计加药浓度达到30 μg/ml开始,CLSMSs收缩的基础相对张力和振幅呈剂量依赖性降低。(1)基础相对张力:当枫蓼肠胃康累计加药浓度达到1000、3000 μg/ml时(P0.05),10000 μg/ml时(P0.01)。(2)基础相对振幅:当枫蓼肠胃康累计加药浓度达到1000 μg/ml及以上时(P0.01)。2.枫蓼肠胃康可抑制不同刺激引起的CLSMSs收缩:与对照相比,从枫蓼肠胃康累计加药浓度达到100 μg/ml开始,不同刺激引起的CLSMSs收缩呈剂量依赖性降低:(1)乙酰胆碱(0.1mmol/L):当其累计加药浓度达到1000 μg/ml时(P0.05),3000、10000μg/ml 时(P0.01);(2)氯化钾(20mmol/L):当其累计加药浓度达到1000μg/ml及以上时(P0.05)。(3)胞内钙库耗竭后胞外钙离子内流:当其累计加药浓度达到1000 μg/ml及以上时,(P0.01)。3.枫蓼肠胃康对乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的抑制作用可被抑制剂部分阻滞:(1)鸟苷酸环化酶抑制剂(methylene blue,MB,10 μmol/L):当枫蓼肠胃康累计加药浓度达到300 μg/ml以上时,乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的相对振幅仍呈剂量依赖性降低,但高于对照(当其累计加药至1000 μg/ml及以上时(P0.05))(2)一氧化氮合酶抑制剂(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME,100 μmol/L):当枫蓼肠胃康累加加药浓度达到1000μg/ml以上时,肌条收缩振幅仍呈剂量依赖性降低,但高于对照(当其累加加药浓度达到 1000 μg/ml 时(P0.05),3000、10000 μg/ml 时(P0.01));(3)电压依赖性钾离子通道阻滞剂(4-aminopyridine,4-AP,50 μmol/L):从枫蓼肠胃康累积加药浓度达到3 μg/ml开始,肌条收缩振幅虽呈剂量依赖性降低,但高于对照(当其累积加药浓度达到 1000 μg/ml 时(P0.01),3000、100000μg/ml 时(P0.05))。实验三:1.枫蓼肠胃康可抑制基础状态下CLSMSs收缩:与模型组比较,枫蓼肠胃康组基础平均张力下降(P0.01)。2.枫蓼肠胃康可抑制乙酰胆碱引起的CLSMSs收缩:与模型组比较,枫蓼肠胃康组由乙酰胆碱引起的收缩平均张力下降(P0.05)。3.枫蓼肠胃康对乙酰胆碱引起CLSMSs收缩的抑制作用可被抑制剂部分阻滞:分别应用L型钙离子通道拮抗剂(nifedipine,10 μmol/L)、一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME,100μmol/L)、胞内钙池拮抗I剂(3,4,5-trimethoxybenzoic acid 8-(diethylamino)octyl ester hydrochloride,TMB-8,20μmol/L)、电压依赖性钾通道阻断剂(4-AP,50 μmol/L)、鸟苷酸环化酶抑制剂(MB,10μmol/L)孵育后,各组由乙酰胆碱引起的平均收缩张力差异无统计学意义(P0.05)。实验四:1.各组基础状态跨上皮电压、基础短路电流、跨上皮电阻差异无统计学意义(P0.05),然而枫蓼肠胃康组有下降趋势。2.枫蓼肠胃康抑制毛喉素引起的氯离子分泌:与模型组相比,枫蓼肠胃康组由毛喉素引起的AIsc降低(P0.05)。3.氯离子替代后,枫蓼肠胃康对毛喉素引起的氯离子分泌抑制作用可被部分阻滞:三组间由毛喉素引起的ΔIsc差异无统计学意义(P0.05)。4.枫蓼肠胃康对毛喉素引起的氯离子分泌抑制作用可被抑制剂部分阻滞:分别应用非选择性氯离子通道阻滞剂(diphenylamine-2-carboxylate,DPC,1 mmol/L,顶膜侧)DPC、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cysticfibrosis transmembrane conductance regulator,CTFR)抑制剂格列本脲(1 mmol/L,顶膜侧)、钠钾氯共转运体(Na-K-Cl cotransporter,NKCC)抑制剂布美他尼(100 mmol/L,基底膜侧)孵育后,三组间由毛喉素引起的ΔIsc差异无统计学意义(P0.05)。结论1.枫蓼肠胃康颗粒可以有效缓解IBS-D大鼠的腹泻症状,改善其内脏高敏感性;2.枫蓼肠胃康颗粒可浓度依赖性的抑制正常大鼠及IBS-D模型大鼠离体结肠平滑肌收缩,其解痉机制可能与阻滞钙离子通道、一氧化氮-鸟苷酸环化酶-环鸟氨酸通路及电压依赖性钾离子通道有关;3.枫蓼肠胃康颗粒可以抑制结肠粘膜上皮氯离子分泌,其止泻机制可能与阻滞顶膜侧氯离子通道(包括囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)及基底膜侧钠钾氯共转运体有关。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

Ｆｅｃａｌ邋ｐｅｌｌｅｔ邋ｎｕｍｂｅｒ：粪便颗粒数（正常组无处理１小时，模型组束缚应激１小的粪便颗粒数的平均值），以ｍｅａｎｓ土ＳＥ表示，ｎ＝８；邋Ｎｏｒｍａｌ：正常组；ＩＢＳ－Ｄ：常组相比，Ｍｐ＜０．０１。逡逑３．１．１．２邋ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠的粪便含水量变化逡逑模型组大鼠粪便含水量（３３．７０±１．４９％）高于正常组（１６．８２±１．５８％），统计学意义（＃Ｐ＜０．０１），提示ＩＢＳ？模型大鼠经母婴分离和束缚应激造组相比大便性状偏稀（图２）。逡逑４０逡逑l:本逡逑一邋３0邋—逡逑Ｓ邋２５－逡逑Ｉ邋２０－逡逑

模型组大鼠粪便含水量（３３．７０±１．４９％）高于正常组（１６．８２±１．５８％），差异有高度逡逑统计学意义（＃Ｐ＜０．０１），提示ＩＢＳ？模型大鼠经母婴分离和束缚应激造模后，与正常逡逑组相比大便性状偏稀（图２）。逡逑４０逡逑l:本逡逑一邋３0邋—逡逑Ｓ邋２５－逡逑Ｉ邋２０－逡逑５逦Ｔ逦極擺：逡逑Ｉ邋１０邋－逡逑■逡逑0邋Ｊ逦逦■逦逦＾逦■逡逑Ｎｏｒｍａｌ逦ＩＢＳ－Ｄ逡逑图２邋ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠的粪便含水量变化逡逑６２逡逑

高于正常组，差异有统计学差异ＣＰ＜0．0５），说明ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠对４0、６０、８0毫米逡逑汞柱的结直肠内球囊压力刺激反应敏感，间接反应出ＩＢＳ－Ｄ大鼠的结直肠痛阈降低、逡逑内脏敏感性增高（图３）。逡逑４邋￣ｊ逡逑□邋■邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑３．５邋－逦＾逦ｆ逡逑＋邋ｍｓ－Ｄ逡逑３邋－逦林邋＾００＾＾逡逑丨Ｐ逡逑0邋５邋－逦ＣＲＤ邋（ｒｎｒｎＨｇ）逡逑０邋Ｈ逦１逦１逦１逦１逦１逡逑0逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逡逑图３大鼠的腹壁回撤反射评分变化逡逑ＡＷＲ邋ｓｃｏｒｅ：腹壁回撤反射评分，以ｍｅａｎｓ士ＳＥ表示，ｎ＝８。Ｎｏｒｍａｌ：正常组；ＩＢＳ－Ｄ：模型逡逑组；ＣＲＤ：结直肠扩张；ｍｍＨｇ：毫米

本文编号：2790471