马尾松花粉多糖的结构分析以及硫酸酯化多糖对肝癌细胞HepG2的影响

发布时间：2020-08-12 13:54

【摘要】：许多研究表明,多糖作为一类重要的生物活性大分子,具有多种功能活性,例如抗氧化,抗肿瘤,降血糖以及提高机体免疫力等。对多糖进行特定的修饰,可以极大提高多糖的生物学活性。本实验室的前期工作已经证明,硫酸化马尾松花粉多糖SPPM60可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,而未硫酸化的多糖PPM60则对HepG2的增殖无显著性影响。此外,SPPM60可以显著降低HepG2胞内钙离子浓度,而PPM60则对[Ca~(2+)]i无显著性影响。大量实验表明,用适当的方法对多糖进行降解,可以提高多糖的生物活性。目前,鲜有对马尾松花粉多糖的降解以及降解后多糖构效关系等方面的研究。因此本实验在结合实验室前期工作的基础上,对马尾松花粉多糖组分进行降解,并通过细胞学实验和NMR技术探究降解后多糖与未降解时相比构效关系的不同。实验主要分为以下几部分内容:一、采用水煮醇沉法从破壁马尾松花粉中提取多糖,并采用三氯乙酸法除去杂蛋白,用TOYOPEARL HW-65S中压凝胶柱层析对80%乙醇沉淀的多糖进行分离纯化,多次重复得到较为均一多糖组分,将其命名为PPM80-B。采用高效凝胶色谱法对多糖组分PPM80-B进行相对分子量的测定,结果测得PPM80-B的相对分子量为317.8K。二、采用酸解法对松花粉多糖PPM80-B进行降解,得到降解后的低分子量多糖组分,命名为DPPM80-B。在与实验一相同的色谱条件下对DPPM80-B进行相对分子量的测定,测得其分子量为3.131K,表明降解是成功的。采用氯磺酸-吡啶法分别对PPM80-B和DPPM80-B进行硫酸酯化修饰,得到酯化后多糖,并分别命名为SPPM80-B和DSPPM80-B。采用氯化钡-明胶比浊法分别对SPPM80-B和DSPPM80-B进行硫酸根取代度的测定,结果测得两者的取代度分别为1.08和1.26。三、MTT法分别探究四种多糖(PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2增殖的影响。实验结果表明,SPPM80和DSPPM80对HepG2II的增殖具有抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。SPPM80对HepG2增殖的抑制作用要强于DSPPM80。200μg/m L作用72h SPPM80对HepG2的抑制率达到31.47%,而相同条件下DSPPM80对HepG2的抑制率则为15.38%。PPM80和DPPM80对HepG2的增殖没有显著地影响。四、应用fura-2探针采用双波长荧光法测定四种多糖(PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2胞内钙离子浓度的影响。实验结果表明,SPPM80和DSPPM80可以降低HepG2胞内钙离子浓度,且SPPM80的作用效果更加显著。PPM80和DPPM80对HepG2胞内钙离子浓度没有显著地影响。五、采用核磁共振波谱法对松花粉多糖的结构进行解析,主要从~1HNMR(氢谱)和~(13)CNMR(碳谱)两方面进行考察。结果显示,构成该多糖的单糖以吡喃环的形式存在,且该多糖是一种中性多糖,不含GalN残基,可能含有乙酰基中甲基氢或氨基糖中于N-乙酰氨基中的甲基氢,有C-6脱氧糖甲基的存在。综上所述,本实验结果表明马尾松花粉硫酸酯化多糖可以抑制肝癌细胞HepG2的增殖,且未降解的多糖组分对HepG2增殖的抑制作用要强于降解后的多糖组分。另外,松花粉硫酸酯化多糖可以显著降低HepG2胞内钙离子浓度,而这也可能是松花粉硫酸酯化多糖调节HepG2细胞活性的一种方式。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
【图文】：

标准曲线,标准曲线,葡萄糖,右旋糖酐

图 2-1 葡萄糖标准曲线Fig.2-1 standard curve of glucose通过以上标准曲线，计算出 PPM80 组分中的多糖含量是 46.7%。4.3PPM80-B 组分相对分子量的测定利用 excel 软件，以右旋糖酐标准品相对分子量的对数值为纵坐标，相应洗脱峰的保留时间为横坐标，进行线性拟合，得到右旋糖酐标准曲线如图2-2所示。

标准曲线,多糖,水提醇沉法,乙醇沉淀

图 2-3 PPM80-C 高效凝胶色谱图Fig.2-3 HPGPC chromatogram of PPM80-B重复进样三次，记录三次洗脱峰的保留时间，计算平均值，然后代入标准曲线公式 y=-0.2582x+11.757，计算得出 PPM80-B 的相对分子量为 317.76K。5. 讨论水提醇沉法是实验室提取植物多糖的经典方法。该方法提取条件比较温和，成本较低，而且避免酸、碱或有机溶剂的污染，但是操作费时费力，且多糖得率不高。根据多糖在不同浓度的乙醇中溶解度不同的原理，本实验通过乙醇分级沉淀得到了四种不同的多糖组分。因 80%乙醇沉淀得到的多糖质量最高，考虑到后续试验的多糖用量，故本实验采用 80%乙醇沉淀的多糖组分进行后续的实验。水提醇沉法得到的粗多糖中除多糖组分外还会含有一些杂质，如一些杂质离子、单糖、小分子寡糖和蛋白质。为了保证后续试验的精确性，需要通过适当的

凝胶色谱,山东师范大学,糖溶液,硕士学位论文

山东师范大学硕士学位论文在第二章实验的色谱条件下，将配置好的 DPPM80-B 糖溶液注入高效液相色谱仪，得到如下凝胶色谱图（图 3-1）4 实验结果4.1 DPPM80-B 相对分子量的测定结果

【参考文献】