鸦胆子中苦木素类化合物的细胞毒性研究

发布时间：2020-08-12 15:34

【摘要】：苦木科植物鸦胆子[Brucea javanica(Linnaeus)Merrill]是一种常绿阔叶灌木,常见于我国南方沿海省份如广西、广东、海南等地,以及在东南亚岛国如印尼、马来西亚、菲律宾等均有分布。其成熟果实鸦胆子又名鸭蛋子、老鸦胆、苦参子、苦榛子等,在中国,其被用作传统的中草药治疗疾病已经有多年的历史,但与此同时,作为一种传统的有毒植物,近年来也时有因误服,用药不当等导致中毒的事件发生。到目前为止,有150多种化合物已经从鸦胆子的种子和果实中分离得到,其中70余种为苦木素类化合物。随着人们对苦木素类化合物的不断探索,多种多样的生物活性得以证实,其中,抗肿瘤的作用的发现让人们对其有了新的认识,并进而可以通过对细胞的毒性作用来探索更为广泛的毒理作用机制。本研究以鸦胆子成熟果实中纯化分离的7种苦木素单体化合物为研究对象,检测了它们对多组不同类别的癌细胞的增殖抑制作用,筛选出四种细胞毒性显著的苦木素单体化合物,并对化合物Bruceine B抑制肿瘤细胞增殖的构-效关系及作用机制进行了初步探讨。第一部分鸦胆子中7种苦木素类化合物对8种肿瘤细胞的细胞毒性筛选目的:检测7种苦木素类化合物(1)鸦胆苦素B(Bruceine B)、(2)鸦胆苦素A(Bruceine A)、(3)鸦胆苦素C(Bruceine C)、(4)鸦胆苦素D(Bruceine D)、(5)Dehydrobruceantinol、(6)Bruceaketolic acid、(7)Yadanzioside G对人肺癌细胞、人胃癌细胞、人子宫内膜癌细胞、人宫颈癌细胞的增殖抑制作用,以期筛选出具有明显抑制肿瘤细胞作用,尤其是抑制肺癌细胞的苦木素化合物。方法:采用4-氮唑盐(MTT)法检测7种苦木素类化合物对人肺癌细胞、人胃癌细胞、人子宫内膜癌细胞、人宫颈癌细胞的抑制作用,并通过梯度浓度处理后的吸光度(OD)值百分比计算各组实验用苦木素化合物的IC_(50)值。结果:(1)100μmol/L的7种苦木素类化合物作用于三种人肺癌细胞(A549、NCI-H292和HCC827)后,化合物1、2、3、4对NCI-H292细胞显示非常强的增殖抑制活性,增殖抑制率分别为82.93%、81.73%、82.69%和81.51%;对A549及HCC827的抑制率均未达到50%;(2)100μmol/L的7种苦木素类化合物处理人胃癌细胞AGS和人宫颈癌HeLa细胞后,化合物1、2、3、4均显示出非常强的增殖抑制活性,增殖抑制率分别为77.78%、79.24%、76.09%、69.71%和96.58%、98.28%、98.52%、97.79%;(3)100μmol/L的7种苦木素类化合物处理三种人子宫内膜癌细胞(HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2)后,其抑制率均未达到50%;(3)化合物5、6、7对NCI-H292等全部实验用肿瘤细胞显示出较弱的增殖抑制活性,抑制率均在20%以下;(4)通过梯度浓度的苦木素化合物1、2、3、4对三种人肺癌细胞增殖抑制率计算百分比,得到四种苦木素化合物的半数抑制浓度(IC_(50)),其中苦木素化合物1、2、3、4对NCI-H292细胞IC_(50)分别为0.70、1.17、0.54和1.46μmol/L。结论:从鸦胆子的成熟果实中分离提取的4种苦木素类化合物1、2、3和4对人肺肿瘤细胞NCI-H292等3种试验用细胞具有明显的抑制活性;以C-20为母核结构的苦木素类化合物的细胞毒活性与C-2位上的羰基有关,改变其框架结构或增加活性基团可能会大大降低其细胞毒活性作用;延长C-15位上的侧链长度对其细胞毒活性影响不大。第二部分鸦胆子中苦木素类化合物Bruceine B对NCI-H292细胞毒性作用的机制探讨目的:已有报导发现中草药制剂中很多成分都具有抗肿瘤活性,他们多是以诱导肿瘤细胞凋亡的方式来发挥作用的。在之前的筛选实验中,四种苦木素化合物(1)Bruceine B、(2)Bruceine A、(3)Bruceine C、(4)Bruceine D对肺癌细胞NCI-H292产生了明显的抑制活性。本部分实验对(1)Bruceine B进行作用机制方面的探讨。方法:(1)采用流式细胞分析技术AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测1μmol/L和10μmol/L的苦木素类化合物Bruceine B作用NCI-H292细胞12h及24 h后细胞的凋亡;(2)采用TUNEL法检测10μmol/L的苦木素类化合物Bruceine B作用于NCI-H292细胞后12及24 h细胞核的形态学变化;(3)采用Western Blot法检测苦木素类化合物Bruceine B作用NCI-H292细胞12及24 h后凋亡蛋白p53、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12及GRP78的变化。结果:(1)Bruceine B对NCI-H292细胞凋亡的影响:1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B处理NCI-H292细胞12 h后,细胞凋亡率分别达到(16.30±0.29)%和(18.72±0.45)%,与对照组(8.32±0.13)%相比,P0.05;1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B处理NCI-H292细胞24 h后,细胞凋亡率分别达到(29.56±1.24)%和(32.47±1.87)%,与对照组(9.01±0.33)%比较,P0.05。(2)TUNEL法进一步验证细胞凋亡的发生:10μmol/L的苦木素类化合物Bruceine B作用NCI-H292细胞12 h及24 h,经荧光显微镜观察阳性细胞个数占细胞总数的百分率分别是(14.89±1.27)%和(29.37±2.25)%,与对照组(4.17±0.36)%相比,P0.05。(3)Bruceine B对NCI-H292细胞内凋亡蛋白p53、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12和GRP78的上调作用:1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B对NCI-H292细胞处理24 h后,细胞内的凋亡通路蛋白p53、Bax、Caspase-3和Caspase-8的表达均有增加,1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B对NCI-H292细胞处理12 h后,Caspase-12及GRP78的表达明显增加。结论:苦木素化合物Bruceine B对人肺癌NCI-H292细胞有明显的诱导凋亡活性;Bruceine B诱导NCI-H292细胞凋亡是通过多种途径共同作用的结果,它可以通过上调NCI-H292细胞p53蛋白,而后激活促凋亡蛋白Bax,也可以由死亡受体执行蛋白Caspase-8进一步引起并最终通过Caspase-3级联反应诱导NCI-H292细胞凋亡;值得注意的是,在低浓度的Bruceine B早期处理中,内质网应激途径GRP78和Caspase-12复合物的作用也可能为鸦胆子中苦木素类化合物Bruceine B引起NCI-H292细胞凋亡的机制之一。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

鸦胆子

鸦胆子成熟果实Fig.1Bruceajavanica(L.)Merr.

化学结构

图 2 实验用 7 种苦木素类化合物的化学结构Fig.2 Chemical structures of 7 quassinoid compoundsfrom Brucea javanica.

鸦胆子,化合物

图 3 鸦胆子中 7 种苦木素化合物抗肿瘤细胞增殖的作用Fig.3 The effects of 7 quassinoid compounds from Brucea javanica on tproliferation of experimental cancer cells ( X±SD, n=3).

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