以GGPPS为靶标筛选治疗非酒精性脂肪肝的天然活性化合物

发布时间：2020-08-12 16:18

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精以外的其他因素导致的肝细胞内脂肪过度沉积,其发展过程一般包括肝脏的单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化等病变,严重的会产生肝硬化,肝脏衰竭甚至肝癌。在西方国家,NAFLD影响约30%的普通人群。近20年,其在亚洲国家增长迅速且呈低龄化发病趋势,中国上海、广州和香港等发达地区成人NAFLD患病率约为15%。该病的患病率在全球范围内持续增加,与肥胖症的增加成平行关系,日趋成为严重的公共卫生问题。目前众多国际指南关于早期NAFLD的治疗策略主要集中在改变生活方式,以及防治伴随的代谢、心血管并发症。但是发展到后期,必须要采用针对肝脏的药物治疗,阻止肝病进展,减少或预防肝硬化肝癌及其并发症的发生。现有的降脂、降糖、降压药,如降血脂类药物他汀类(Statins)、贝特类(Fibrates),能够降低血脂,与此同时容易导致肝毒性,诱发加剧肝损伤;降血糖类药物二甲双胍(metformin),增强胰岛素敏感性,但是对肝脏的组织学病变并无明显疗效。因此保肝药物,特别是特异性逆转和治疗肝脏脂肪病变、炎症损伤,预防纤维化甚至肝硬化新药的研发至关重要。NAFLD是遗传-环境-代谢-应激等多重因素共同作用的结果,与胰岛素抵抗、高血糖及高血脂等代谢综合征密切相关。在我们以往的研究中,发现蛋白质异戊二烯化修饰过程中的一个重要分支酶,催化法尼基焦磷酸盐(farnesyl diphosphate,FPP)合成香叶基香叶基焦磷酸盐(geranylgeranyl diphosphate,GGPP)的香叶基香叶基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)参与了肥胖诱发的肝脏脂肪变性。GGPPS通过调控体内FPP/GGPP的比例参与调控肝脏的脂质代谢。敲除GGPPS能够有效的缓解NAFLD的形成,因此我们提出以GGPPS为靶点筛选NAFLD有效治疗药物的研究方向。我们发现采用已知的GGPPS竞争性结合抑制剂二磷酸盐DGBP(Digeranyl bisphosphonate)处理高脂诱导NAFLD小鼠,肝脏脂质积累得到有效抑制。由于DGBP较大的毒副作用,使得其针对NAFLD的病情控制较为局限。但是仍然提示我们以GGPPS为靶点抑制NAFLD的发展是一个很好的研究方向。在已有研究基础上,我们针对GGPPS蛋白进行构象分析,与江苏省中西医结合医院药物筛选平台合作,初步计算机模拟筛选出46种可能与GGPPS特异性结合的化合物。随后,我们构建GGPPS绿色荧光融合蛋白,利用微量热泳动技术(MicroscaleThermophoresis,MST)进一步鉴定出了一种与 GGPPS 蛋白直接结合的天然活性小分子化合物,即苹果、苹果树皮及叶中存在的酚类物质——叠氮化根皮苷素(4-Azidophlorizin,4-Az)。叠氮化根皮苷素曾被报道作为肾脏表达的钠-葡萄糖协同转运蛋 2(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT-2)抑制剂,可以抑制肾脏对葡萄糖的重吸收,但是尚未有研究显示4-Az是否具有抑制NAFLD的作用。因此,本文将着重研究4-Az是否能够通过与GGPPS的结合,抑制肝脏甘油三酯的堆积并减缓NAFLD的发展。首先,我们利用GGPPS高表达的MEF细胞TSC2-null作为药理研究模型,将筛选出的特异性结合药物4-Az按照不同浓度及时间分别处理,GGPPS表达呈浓度、时间依赖性下降,转录水平无变化,预示GGPPS可能发生蛋白质降解;同时,分离4-Az处理后异戊二烯化(有机相)和非异戊二烯化(水相)的小G蛋白RhoA,检测发现4-Az造成RhoA异戊二烯化水平下降,预示其引起GGPPS异戊二烯化功能的改变。随后,我们分别在细胞和动物水平进行药效实验。细胞水平上,在GGPPS高表达引起的脂肪变性肝细胞中,4-Az引起GGPPS降解从而降低脂质合成相关基因的表达。在游离脂肪酸处理的脂肪变性肝细胞模型中,4-Az通过下调GGPPS明显减轻脂质积累。动物水平上,高脂喂养诱发小鼠发生肝脏脂肪变性,CT扫描结果显示肝脏中脂质含量增多,解剖后肝脏的整体外观发白及肿胀,HE染色显示大泡型脂肪变性。而在4-Az处理的小鼠肝脏中脂肪变性的表型明显逆转,肝脏中的甘油三酯含量下降,同时血清中转氨酶水平下降,肝功能改善。在机制研究方面,根据细胞内蛋白质降解的两个途径,泛素化-蛋白酶体途径和溶酶体途径,我们利用两种途径的抑制剂MG132、CQ分别抑制药物造成的蛋白质降解,结果显示MG132处理后GGPPS蛋白的泛素化程度加深,从而明确药物造成的降解途径为泛素化-蛋白酶体通路。我们进一步利用免疫沉淀GGPPS结合蛋白的质谱实验获得可结合GGPPS的E3泛素化连接酶候选蛋白,从而明确4-Az引导GGPPS降解的具体机制。由此,我们研究表明,在游离脂肪酸处理的脂肪变性肝细胞及高脂诱导的NAFLD小鼠模型中,4-Az都起到明显降低脂质积累的效果。这一现象主要是由于4-Az通过结合并引导高表达的GGPPS走向泛素化-蛋白酶体降解。以上结果显示,4-Az很有可能是靶向GGPPS有效治疗NAFLD的天然药物小分子。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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