莪术成分Zedoarondiol对血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤的影响

发布时间：2020-08-14 07:23

【摘要】：血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)发生发展的关键环节。血小板源性生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)是血管损伤后释放的生长因子,是促进VSMCs增殖的强效促细胞有丝分裂剂。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是引起内皮细胞损伤的重要因素。ox-LDL刺激内皮细胞发生氧化应激及炎症反应,从而引起内皮细胞损伤。Zedoarondiol是从中药莪术中提取出的成分,属于倍半萜类化合物,具有抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应、减轻D-半乳糖胺引起的肝损伤的作用。我们前期研究发现,以Zedoarondiol为主要成分的涂层支架可以显著抑制冠状动脉球囊损伤小型猪新生内膜增生,促进血管内皮化,其具体作用机制尚未阐明。基于前期研究,我们提出“Zedoarondiol通过腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)途径抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖、通过转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)途径减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤”的假说。围绕该假说,我们进行了两方面的研究:(1)研究Zedoarondiol对PDGF-BB诱导的VSMCs细胞数、细胞活力、DNA合成及细胞周期的影响,以及对AMPK信号通路的作用;(2)研究Zedoarondiol对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激、炎症反应的影响,以及对Nrf2信号通路的作用。研究一Zedoarondiol对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖的影响目的:证实莪术成分Zedoarondiol通过AMPK信号通路,抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖。方法:采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs,以PDGF-BB(20ng/m L)诱导VSMCs增殖。细胞计数法检测Zedoarondiol对PDGF-BB诱导的VSMCs细胞数的影响,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测对细胞活力的影响,Brd U掺入法检测Zedoarondiol抑制PDGF-BB诱导的VSMCs DNA合成的影响,流式细胞术分析Zedoarondiol对细胞周期的影响,Western blotting检测Zedoarondiol对AMPK、p-AMPK、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl Co A carboxylase,ACC)、p-ACC、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、p-m TOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)、p-p70S6K、细胞周期依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、cyclin E、p53、p21蛋白表达的影响。结果:与control组相比,PDGF组VSMCs细胞数、细胞活力、DNA合成均增加(P0.05),VSMCs细胞周期G0/G1细胞数减少(P0.05),S期细胞数增加(P0.05)。与PDGF-BB组相比,Zedoarondiol(20μg/m L)预处理可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞数(P0.05)、细胞活力、DNA合成(P0.05),增加VSMCs细胞周期G0/G1细胞数(P0.05),减少S期细胞数(P0.05),而对PDGF-BB处理的VSMCs细胞凋亡无明显影响(P0.05)。Zedoarondiol(5~40μg/m L)对正常培养的VSMCs细胞活力无明显影响(P0.05)。Western blotting显示:Zedoarondiol可上调PDGF-BB处理的VSMCs AMPK、ACC磷酸化和p53、p21蛋白表达(P0.05),下调m TOR、p70S6K磷酸化和CDK2、cyclin E蛋白表达(P0.05)。Zedoarondiol与AMPK激活剂compound C共同预处理(PDGF+Zed+compound C组),可减弱Zedoarondiol对VSMCs增殖的抑制作用,表现为与PDGF+Zed组相比,PDGF+Zed+compound C组VSMCs细胞数、细胞活力、DNA合成增加(P0.05);与AMPK抑制剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-呋喃核糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-ribofuranoside,AICAR)共同预处理(PDGF+Zed+AICAR组),可加强Zedoarondiol抑制VSMCs增殖的作用,表现为与PDGF+Zed组相比,PDGF+Zed+AICAR组VSMCs细胞数、细胞活力、DNA合成进一步下降(P0.05)。结论:Zedoarondiol抑制PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs增殖,机制可能与活化AMPK、抑制下游的m TOR/p70S6K信号通路和上调p53/p21信号通路相关。研究二Zedoarondiol对ox-LDL诱导的血管内皮损伤的影响目的:证实莪术成分Zedoarondiol通过Nrf2途径减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。方法:以ox-LDL(150μg/m L)刺激HUVECs 24h,建立内皮细胞损伤模型。采用CCK-8法及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性检测观察Zedoarondiol对ox-LDL刺激的内皮细胞的保护作用,检测丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力以观察内皮细胞氧化应激状态,以二氯荧光素双醋酸盐(dichlorodihydrofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,酶联免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)检测细胞上清白介素-1β(interleukine-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的含量,细胞免疫荧光染色观察Zedoarondiol对Nrf2核转位的影响,Western blotting检测Zedoarondiol对IL-1β、TNF-α、MCP-1、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和Nrf2蛋白表达的影响。结果:与control组相比,ox-LDL组内皮细胞活力和SOD活性显著下降(P0.05),细胞培养上清LDH活力、细胞内MDA及ROS水平、细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和MCP-1水平均显著升高(P0.05)。Western blotting结果显示,IL-1β、TNF-α和MCP-1蛋白表达升高(P0.05)。与ox-LDL组相比,Zedoarondiol(20μg/m L)预处理显著升高内皮细胞活力(P0.05),降低细胞培养上清LDH活力及细胞内MDA、ROS水平(P0.05),上调SOD活性(P0.05)。Zedoarondiol预处理还可降低细胞培养上清IL-1β、TNF-α和MCP-1水平(P0.05),抑制IL-1β、TNF-α和MCP-1蛋白表达(P0.05)。Zedoarondiol对正常培养的HUVECs细胞活力、细胞内MDA和ROS水平、SOD活性,细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和MCP-1水平及其蛋白表达均无明显影响(P0.05)。细胞免疫荧光结果显示,Zedoarondiol可促进胞浆Nrf2向细胞核内转位。Western blotting结果显示,Zedoarondiol可上调细胞核组分Nrf2及HO-1的蛋白表达(P0.05)。Zedoarondiol与Nrf2抑制剂全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)共同预处理(ox-LDL+Zed+ATRA组),则可减弱Zedoarondiol对ox-LDL刺激的内皮细胞的保护作用,表现为与ox-LDL+Zed组相比,ox-LDL+Zed+ATRA组MDA含量升高、SOD活性下降(P0.05)。结论:Zedoarondiol可减轻ox-LDL诱导的内皮细胞氧化应激及炎症反应,保护内皮细胞,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路相关。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

Figure 1. The mechanism underlying curcumin-mediated cytostatic action in VSMCs.图 1. 姜黄素抑制 VSMCs 增殖的机制图（Lewinska et al, 2015）4 小结与展望VSMCs 增殖是 AS 及 ISR 发生发展的重要环节。因而，抑制 VSMCs 对防治 AS 及ISR 具有重要意义。研究显示，莪术有效成分具有抑制 VSMCs 增殖的作用，其机制可能与 MAPK/ERK、PI3K/Akt、HO-1 信号通路相关。纵观目前研究来看，仍存在以下几个问题：（1）在莪术有效成分中，对姜黄素的研究较多，而其余有效成分的抗 VSMC增殖的研究较少，其药理作用及其作用机制仍待我们进一步探索；（2）在体实验周期仍较短，最长为 90 天，因而莪术有效成分抗 AS、ISR 的远期效应仍有待证实；（3）作为抗 ISR 的可能药物，莪术有效成分作为涂层支架药物使用，其质量的稳定性和安全性方面的研究仍缺乏。综上所述，莪术有效成分在防治 AS 及 ISR 方面，展现出广阔的前景，应进一步完

中发挥重要作用[26,27]。如，在 AS 发生发展中，内皮细胞凋亡可导致内皮完整性的，增加斑块的易损性，导致粥样硬化斑块的不稳定，进一步触发斑块破裂[28]。ox-LD管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）、氧化应激等是 AS 形成过程中导致内皮细亡的主要因素。内皮细胞的凋亡主要有 3 个途径（图 1）：（1）线粒体通路：在各种亡因素作用下，线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeability transit pore，mPT放，细胞色素 C 从线粒体中释放，活化 caspase-9，进而活化 caspase-3，启动 casp联凋亡反应。caspase-3 是级联反应中最重要的蛋白酶之一，是多个凋亡通路的共同靶点。此通路由 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族参与调控。（2）网通路：该通路主要有三条途径，即 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous proteinHOP）途径、JNK 途径和 caspase-12 途径。（3）死亡受体通路：该通路也成为外源亡途径，典型的死亡受体为 Fas 和肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptoNFRs）[29,30]。

图 1. Zedoarondiol 化学结构图igure 1. Chemical structure of zedoarond，我们提出“Zedoarondiol 通过 AMrf2 途径减轻 ox-LDL 诱导的内皮的研究：（1）采用 PDGF-BB 诱导PDGF-BB 诱导的 VSMCs 增殖、D号通路的影响；（2）建立 ox-LDdothelial cells，HUVECs）损伤的化应激、炎症反应及 Nrf2 信号通、ISR 等疾病中的应用提供实验依

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本文编号：2792703