脱水穿心莲内酯对小鼠胆管结扎诱导的肝纤维化的抑制作用及机制探讨

发布时间：2020-08-14 09:06

【摘要】：目的该课题是利用小鼠胆管结扎(BDL)模型探讨脱水穿心莲内酯(DA)对小鼠胆汁淤积诱导的肝纤维化的保护作用;同时,通过体外培养人LX-2细胞探讨DA在肝纤维化过程中的作用机制。方法动物实验:40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组:羟甲基纤维素(CMC)+假手术(sham)组、DA+sham组、CMC+BDL组和DA+BDL组,每组10只小鼠。BDL组小鼠进行胆总管双重结扎并中间离断,sham组小鼠进行假手术,胆总管只穿线不结扎。DA+sham组和DA+BDL组小鼠给予DA灌胃(100mg/kg)给药,每日一次,同时CMC+sham组和CMC+BDL组小鼠给予灌服相同剂量的CMC。连续灌胃5d后各组小鼠进行相应的手术,术后12h继续灌胃给予每只小鼠相应组别的药物治疗。连续7d后处死小鼠收集血清和肝脏标本,做以下检测:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)试剂盒检测血清中ALT、TBIL和TBA浓度;小鼠肝脏石蜡切片HE染色,镜下观察肝组织病理形态变化,天狼猩红染色观察肝纤维化程度;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中肝纤维化相关基因的相对表达量,包括转化生长因子-β(TGF-β)、I型胶原α1(Col1a1)mRNA表达;Western blot检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的相对表达量。体外细胞实验:体外培养人LX-2细胞,使用TGF-β激活LX-2细胞。分为空白溶剂(DMSO)对照组、DA组(20μM/L)、TGF-β组(2ng/ml)、低剂量DA(5μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组、中剂量DA(10μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组和高剂量DA(20μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组。qRT-PCR检测各组细胞中Col1a1mRNA相对表达量。Western blot检测各组细胞中α-SMA的蛋白相对表达量。结果动物实验:在小鼠实验中,我们发现CMC+BDL组小鼠血清中ALT、TBIL和TBA的水平显著上升(P0.01),但给予DA后,这些生化指标的水平显著降低(P0.01),肝损伤明显减轻;肝脏形态学分析显示,HE染色可见,与CMC+sham组相比,CMC+BDL组小鼠肝小叶结构被破坏,肝索断裂,在汇管区有大量的炎性细胞的浸润,胆管壁明显增厚,并出现明显的增生,有大量的弥漫性、点状样肝细胞坏死灶;与CMC+BDL组相比,DA+BDL组小鼠病理损伤明显改善,炎性细胞浸润明显减少,坏死灶明显减少。天狼猩红染色结果显示,与CMC+sham组相比,CMC+BDL组小鼠肝组织中汇管区周围出现大量胶原纤维沉积;与CMC+BDL组相比,DA+BDL组小鼠肝组织汇管区周围胶原纤维沉积明显减少,纤维程度减轻(P0.01)。同时qRT-PCR和Western blot结果显示,与CMC+sham组比较,CMC+BDL组小鼠肝组织中TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表达水平升高;DA明显降低了小鼠肝组织中BDL诱导的TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表达水平的升高,差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。体外细胞实验:qRT-PCR和Western blot结果显示DA治疗能够显著抑制TGF-β激活的人LX-2细胞中Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白的表达(P0.05或P0.01)。结论DA对BDL诱导的小鼠肝损伤具有保护作用;DA可能通过抑制纤维化相关因子的表达,进而减少肝星状细胞(HSC)的活化,达到抗纤维化的作用。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

DA化学结构式

15图 2 各组小鼠血清 ALT、TBIL、TBA 水平注：A- ALT 水平；B- TBIL 水平；C- TBA 水平；*P<0.05，**P<0.01。

二、 DA 对胆管结扎诱导的小鼠肝脏组织病理学的影响HE 结果显示：CMC+sham 组和 DA+sham 组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝实质内偶见少量的炎性细胞，无胆管的增生。CMC+BDL 组小鼠肝小叶结构被破坏，肝索断裂，在汇管区有大量的炎性细胞的浸润，胆管壁明显增厚，并出现明显的增生，有大量的弥漫性、点状样肝细胞坏死灶。与 CMC+BDL 组相比，DA+BDL 组小鼠病理损伤明显改善，炎性细胞浸润显著减少，胆汁淤积性肝细胞坏死灶的面积明显减少（图 3）。天狼猩红染色结果显示：CMC+sham 组和 DA+sham 组小鼠，仅见少量染成红色的胶原纤维围绕在胆管和一些大的静脉周围。CMC+BDL 组小鼠肝组织中汇管区周围胶原纤维大量沉积。对比 CMC+BDL 组，DA+BDL 组小鼠肝组织内汇管区周围胶原纤维沉积明显减少，纤维程度减轻（图 4）。

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本文编号：2792815