鲜土贝母二氯甲烷提取物抗肝母细胞瘤的机制研究

发布时间：2020-08-14 10:24

【摘要】：在儿童肝脏的恶性肿瘤中,肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)占首位。统计数据表明,HB的发病率约为1.2-1.5/106,且大多数发生于5岁以前。HB的临床治疗以手术和化疗为主。少数患者发现时处于早期,可手术完全切除。切除后如果存在危险因素,需要进行辅助化疗。病灶不能完全切除的患者,实行新辅助化疗可降低疾病分期,争取切除机会。晚期患者的治疗主要以化疗和支持治疗为主。得益于新型治疗药物的开发和手术方式的进步,HB的生存率较以往已经有了较大的提高。化疗不仅有利于提高手术治疗的可能行,还能有效提高无法切除患者和远处转移患者的生存率。但是,常规化疗强烈的毒副作用限制了HB疗效的进一步提高。目前,临床治疗的主要策略是控制化疗药物剂量和开发新的治疗药物,以减少化疗相关毒性事件的发生,从而改善HB患者的整体预后。中药中有大量的药物被证实具有抗肿瘤活性,为遴选新的抗肿瘤药物提供了资源。土贝母长期以来被用来治疗包括肿瘤在内的多种内外科疾病。现代研究证实,其主要有效成分皂苷类具有广谱的抗肿瘤活性,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡和周期阻滞。鲜土贝母二氯甲烷提取物(ETBM)不同于以往提取方式所获得的的化合物。实验证实,ETBM能有效抑制转移性三阴乳腺癌的增殖和转移,具有开发成新型抗肿瘤药物的潜质。本实验将ETBM应用于HB细胞系及裸鼠移植瘤模型,观察其抑制裸鼠移植瘤生长的效果,探讨其抗HB的机制。以期为开发新的抗HB药物提供线索。本实验用HepG2细胞作为HB的细胞模型,用裸鼠皮下移植瘤作为HB的疾病模型,通过分析细胞增殖、观察形态学改变、检测信号转导关键蛋白等多种实验手段揭示ETBM抗HB的机制。实验发现,ETBM对HepG2细胞具有剂量依赖的抑制作用,其IC50为113.10±12.13μg/ml。ETBM处理过的HepG2细胞内可见大量空泡产生。发生空泡化的细胞在电镜下可见胞质内结构清晰的自噬小体和自噬溶酶体。免疫印迹实验可见自噬标志性蛋白LC3Ⅱ和p62的表达发生显著改变(P0.05)。免疫荧光分析可见LC3Ⅱ和p62的表达和分布发生显著性改变。由此可推断,ETBM诱导HepG2细胞发生了自噬,且自噬程度与ETBM浓度成正比。本实验应用流式细胞术以检验ETBM抑制HepG2增殖时是否发生细胞凋亡和周期阻滞。结果显示,不同浓度ETBM作用HepG2细胞12小时或24小时,均未见细胞发生早凋亡或周期阻滞。说明ETBM诱导HepG2细胞发生自噬不伴有细胞凋亡或细胞周期阻滞。据此推测ETBM诱导HepG2细胞发生了自噬性细胞死亡(Autophagic cell death,ACD)。为证实这一推论,本实验应用了自噬抑制剂PIK-Ⅲ以抑制ETBM诱导HepG2细胞发生的自噬。结果发现,PIK-Ⅲ单独或与ETBM同时作用于HepG2细胞,胞质内可见大量空泡化形成,但电镜下并未发现自噬小体和自噬溶酶体。不仅如此,LC31I和p62的表达和在细胞内的分布也指向与自噬水平被抑制的状态。说明PDC-Ⅲ能抑制ETBM诱导HepG2细胞发生的自噬。按照细胞死亡命名委员会(The Nomenc-lature Committee on Cell Death,NCCD)的标准,ETBM诱导HepG2细胞发生了ACD,是其发挥抗肝母细胞瘤的主要机制。本实验将HepG2细胞用PBS-基质胶混合溶液重悬后接种于裸鼠腋下皮下,其成瘤率约为83.33%,而单纯使用PBS重悬后接种的成率约为16.67%(P0.01)。BS-基质胶混合溶液重悬HepG2细胞后接种作为裸鼠移植瘤模型的造模方法。造模成功后随机分组,别给予去离子水灌胃、奥沙利铂腹腔注射、ETBM低浓度和高浓度灌胃4周。结果发现,奥沙利铂能显著抑制裸鼠移植瘤的生长,其肿瘤抑制率约为56.73%,低剂量ETBM的肿瘤抑制率为34.93%,高剂量ETBM的肿瘤抑制率为37.88%(高低计量之间无统计学差异)。奥沙利铂组小鼠体重持续降低,明显低于其余各组(P0.05),ETBM组与正常组之间无差异(P0.05),说明奥沙利铂具有较强的毒性,而ETBM的耐受性较好。本实验应用高效液相色谱-时间飞行质谱(High performance liquid chromate-graphy time off-flight mass spectrome-try,HPLC-TOF MS)分析了ETBM所含的活性成分,共鉴定出10种含量较高化合物。其中豆留醇和葫芦素E等在既往研究中被证实具有广泛的抗肿瘤活性,能有诱导多种肿瘤细胞发生凋亡和周期阻滞。ETBM抑制HepG2细胞增殖、诱导ACD的具体化合物有待进一步研究。综上所述,ETBM在体内能明显抑制HB移植瘤的生长,且具有良好的耐受性,在体外能通过诱导HepG2细胞发生ACD发挥抗肿瘤活性。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

透射电镜,自噬,箭头,溶酶体

２．３结果逡逑ＥＴＢＭ作用过的ＨｅｐＧ２细胞在光学显微镜下仍可见胞质空泡化形成，而作逡逑为空白对照的0．１％ＤＭＳＯ组未见明显空泡化。透射电镜可观察到（图２），逡逑０．１％ＤＭＳＯ组可见明显细胞亚结构（绿色箭头为椭圆形线粒体）；ＥＴＢＭ逡逑２５ｐｇ／ｍｌ组可见双侧膜结构的自嗤小体（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ，ＡＶｉ，黄色箭头），逡逑ＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ组可见内容物己进一步降解的单层膜结构的自噬溶酶体（Ａｕｔｏ－逡逑ｌｙｓｏｓｏｍｅ，ＡＶｄ，红色箭头）。逡逑ＤＭＳＯ邋０．１％逦ＥＴＢＭ２５Ｍｇ／ｍｌ逦ＥＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ逡逑ｆｔ，邋ｍｍ逡逑＿■魏，n：：逡逑图２透射电镜图像逡逑（绿色剪头：线粒体；黄色箭头：自噬小体，ＡＶｉ；红色箭头：自噬溶酶体，ＡＶｄ）逡逑６０逡逑

标准曲线,标准曲线,土贝母,肝母细胞瘤

BCA蛋白定量标准曲线

免疫印迹,土贝母,肝母细胞瘤,机制

免疫印迹(Westernblotting)

【相似文献】