脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响及加味补阳还五汤的改善作用研究

发布时间：2020-08-14 13:59

【摘要】：目的脓毒症相关性脑病(sepsis associated encephalopathy,SAE)是脓毒症的常见并发症,它的出现与脓毒症患者的病死率增高、远期认知功能、生活质量密切相关。这种远期认知损伤的机制尚不明确,预防和改善SAE疾病还没有有效的方法。因此本研究采用经典的盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)构建脓毒症小鼠模型,通过对存活小鼠的行为评价,利用双光子显微镜检测脑类淋巴清除通道功能,以及靶向代谢组学研究相关代谢物,探讨SAE的脑损伤机制,为SAE的治疗提供理论基础。同时,基于所建立的SAE疾病模型,初步评价加味补阳还五汤(JBH-5)对SAE的治疗作用以及对脑代谢物清除的影响。方法1.脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响采用CLP手术诱发小鼠脓毒症,对急性脓毒症存活小鼠进行术后11 d及30 d的行为学分析及术后30 d脑组织的病理变化及神经元的损伤情况;通过双光子荧光活体成像技术对术后30 d小鼠的脑血管旁通道进行活体监测;同时利用免疫荧光检测48 h和30 d小鼠脑组织中神经元(Neun)、小胶质细胞及星形胶质细胞的表达和水通道蛋白4(AQP4)的极化水平;基于液质联用技术(LC-MS/MS),采用靶向代谢组学的研究手段,挖掘CLP术后30 d存在认知损伤的小鼠脑组织的生物标志物。2.JBH-5对小鼠脓毒症脑病的改善作用将9~10 W的C57/B6雄性小鼠随机分成Sham组、CLP组、阳性对照组(头孢哌酮0.2275 g/kg)、JBH-5高剂量组(50 g/kg)、JBH-5中剂量组(25 g/kg)、JBH-5低剂量组(12.5 g/kg)。采用CLP法建立小鼠SAE模型,术后连续给药30 d后,对不同组小鼠进行Morris水迷宫测试行为学指标,HE染色及尼氏染色观察脑组织病理学变化;利用双光子活体成像技术测定小鼠脑旁血管清除通路功能,以及免疫荧光技术检测各组小鼠脑组织小胶质细胞、星形胶质细胞及AQP4的变化。结果1.脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响CLP手术12 d后小鼠的存活率为35%;术后24 h CLP组小鼠神经行为学评分显著降低(P0.05);术后11 d及30 d的行为学分析结果表明CLP组小鼠出现空间记忆认知能力的损伤。术后30 d的HE染色及尼氏染色显示CLP组小鼠的脑组织出现损伤及海马体神经元数目减少。术后30 d的双光子活体成像结果表明,脑脊液荧光示踪剂在CLP小鼠脑实质和脑血管周围间隙中出现堆积,且在脑实质组织中的清除速率明显减慢。术后48 h及30 d CLP小鼠脑组织的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增多,而胶质纤维酸性蛋白(Iba1)在术后48 h显著活化,到术后30 d则为静息状态,且AQP4主要表达在星形胶质细胞胞体区域,即其极化水平显著降低(P0.05)。术后30 d的靶向代谢组学结果显示存在认知损伤的CLP小鼠脑内存在15个差异代谢物,其中腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)、黄嘌呤核苷、鸟苷、尿酸这5个生物标志物涉及嘌呤代谢途径。高表达的尿酸可能为SAE诊断和治疗的潜在生物标志物。2.JBH-5对小鼠脓毒症脑病的改善作用与CLP对照组比较,阳性对照组及JBH-5低剂量组术后12 d的存活率及术后24 h神经行为学评分明显提高(P0.05)。给药30 d后的行为学分析表明,JBH-5低剂量组小鼠空间记忆认知能力明显改善。脑组织病理观察可知,给药30 d后的JBH-5具有改善由于CLP导致的海马区神经元固缩、深染、神经元细胞减少的情况。荧光示踪剂在JBH-5小鼠脑实质组织中的清除速率明显加快(P0.05),有效降低荧光示踪剂在脑实质和脑血管周围间隙中的堆积,且小鼠脑组织中的GFAP活化减少(P0.05),各组Iba1无明显变化。JBH-5组中AQP4主要表达在星形胶质细胞端足区域,与CLP组比较极化水平显著提高(P0.05)。结论1.脓毒症存活小鼠能引起学习和空间识别记忆能力的下降。2.脓毒症引起小鼠脑类淋巴清除通道发生显著损伤,星形胶质细胞持续过度活化,AQP4去极化。3.脓毒症引起小鼠脑内的小胶质细胞一过性活化,星形胶质细胞持续过度活化,神经元减少。4.脑靶向代谢组学结果显示,CLP模型中存在认知损伤的小鼠主要表现嘌呤代谢紊乱,脑内尿酸增多。5.JBH-5能显著改善由CLP引起的小鼠空间记忆认知功能的损伤。6.JBH-5能改善脓毒症小鼠类淋巴清除通路功能,抑制星形胶质细胞的过度活化,降低AQP4去极化水平。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

示意图,脑损伤,淋巴,大脑

被清除出脑实质，是脑内代谢物清除的重要途径之一。针对活体脑内类淋巴系统的研究，在帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病及其他神经炎症相关疾病模型国内外陆续有报道，正常大脑与脑损伤的淋巴通路对比如图1-2所示[29]。生理条件下，脑血管周围间隙在脑脊液与脑组织间液的液体引流、物质转运方面有重要的作用，因此血管周围间隙的物质转运功能可为认识SAE的病理、生理过程提供全新的视角[30]。图 1-2 健康大脑和脑损伤淋巴通路功能示意图[29]Figure 1-2Aschematic diagram of the function of the glymphatic pathways in the healthy brain andbrain injury星形胶质细胞的水转运通道与类淋巴系统功能的维持密切相关，通过星形胶质细胞端足上的水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP4）构成的水通道，促使CSF-ISF进行液体交换，排除脑组织之间的代谢物。APQ4是脑组织中表达最多的水通道蛋白，是构成星形胶质细胞的水转运通道重要蛋白。生理情况下，它以一种高度极化的方式在血管周围的星形细胞端足上表达

小鼠,时间点,稀释液,白介素-10

观察记录小鼠情况并进行神经行为学评分[58]，评分项目见图2-1。同时，对小鼠生存率进行 12 d 的统计、以及 11 d 和 30 d 小鼠体重的恢复情况。CLP 术后各时间点采集小鼠 110 μL 血样，将其中 50 μL 作为血液原液，吸取剩余 50 μL用无菌 PBS 连续稀释（1:9）。将稀释液和原液均匀涂布在胰蛋白酶血平板上，每个稀释液梯度做两个重复涂板。将平板放在恒温培养箱 37℃培养 24 h 后计算每个样品的菌落数检测小鼠血液细菌量。载菌量（CFU/mL）=同一稀释度两个平皿上菌落的平均数×稀释倍数×20。CLP 术后各时间点采集抗凝血，通过血液分析仪检测白细胞（WBC）的变化。CLP 术后各时间点采集血浆，利用 Luminex 液相芯片技术检测白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α?

Morris水迷宫,小鼠,实验结果,游泳速度

出现细胞因子风暴，小鼠出现死亡。型小鼠认知功能的变化1 2 3 4 5 6 7CLP: 11 dSham: 30 dCLP: 30 dSham: 11 d************时间（d）11 300246* **术后时间（d）穿越平台次数11 30ShamCLP**术后时间（d）11 3001020304050ShamCLP*术后时间（d）象限距离百分比%11 3005101520*术后时间（d）平均游泳速度(m/s) (b)(d) (e))

【参考文献】