地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理
发布时间：2020-08-14 16:11
【摘要】：皮肌炎(dermatomyositis,DM)是一种主要累及皮肤和骨骼肌的自身免疫性结缔组织病,死亡率高,并发症多,危害大。DM的临床西医治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂为主,疗效有限,毒副作用大,依赖性强;中医辨证施治有优势;皮肌炎常见症候有肝郁,脾虚,血热,根据疏肝,健脾,凉血治则,选用出自明代薛己《内科摘要》的加味逍遥丸经方,其中含有的柴胡皂苷a,阿魏酸,芍药苷,苍术酮,丹皮酚等单体具有抗炎抗过敏和免疫调节作用。地乌为毛茛科银莲花属植物林荫银莲花的根茎,临床治疗自身免疫病效果满意;本课题在前期工作基础上,从抑制巨噬细胞JAK2-STAT3通路,探讨地乌增强加味逍遥丸抑制皮肌炎免疫亢进的免疫药效及药理。1.皮肌炎大鼠模型建立[目的]建立皮肌炎大鼠药效学模型。[方法]SD大鼠48只随机分为对照组和不同条件造模组共6组,除对照组外,其它造模大鼠于dd0,d7,d14,d28膜抗原致敏,d42,d49,d56,d63膜抗原发敏,d77各组分别给予二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素或三药联合,对照组同步给予生理盐水,建立皮肌炎大鼠模型。d91处死动物,以症状评分观察机能变化,HE及von kossa染色观察肌肉,皮肤病理改变;ELISA检测血清抗体(Jo-1/MDA5)与细胞因子(TNF-α/IFN-γ)。[结果]各造模组出现明显肌无力症状,血清中抗Jo-1抗体,抗MDA5抗体,TNF-α,IFN-γ均有不同程度升高;肌肉组织有不同程度的淋巴细胞浸润,多粘菌素组和三药联用组可见显著血管钙化,其中三药联用组病变最为明显。[结论]以膜蛋白诱导自身免疫损伤,环境毒物诱导钙化防御,优化了大鼠皮肌炎的造模条件;该模型符合临床发病,可用于药效评价。2.地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效[目的]探讨地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效。[方法]108只SD大鼠雌雄各半,分为对照组,模型组,他克莫司组,地乌组,加味逍遥丸组,加味逍遥丸含地乌组,每组18只;除对照组外,其余造模动物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42发敏,d63给药二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28开始每日灌胃给药,他克莫司(0.0056～176.71mg·kg-1·d-1,k=3.16),地乌(1.06～1060.23 mg·kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遥丸(1.83～18173.79 mg.kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遥丸含地乌(2.81～27919.42 mg·kg-1·d-1,k=3.16),d70处死动物,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肌肉病理变化,形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化防御,形态计量钙化结节体积比;免疫组化法检测肌肉切片foxp3,IL-17RA,JAK2,STAT3表达量;各指标用Graphpad Prism 5软件非线型可变斜率回归不同药物的半数有效剂量(median effective dose,ED50),确定方剂药效。[结果]各给药组防治皮肌炎呈剂量依赖趋势,量效曲线呈“S”型。复方及其单体组显著缓解肌肉T淋巴细胞浸润比,钙化结节体积比,增高肌肉中foxp3表达量,降低IL-17RA,JAK2,STAT3表达量。以地乌剂量为标识,与地乌组相比,加味逍遥丸加地乌组曲线左移,T淋巴细胞浸润体积比,钙化结节体积比,IL-17RA表达量,Foxp3表达量JAK2表达量,STAT3表达量ED50是地乌组的0.70倍,0.44倍,0.74倍,0.81倍,0.35倍,0.60倍;以加味逍遥丸剂量为标识,与加味逍遥丸组比,同等剂量下加味逍遥丸加地乌组曲线左移,T淋巴细胞浸润体积比,钙化结节体积比,IL-17RA表达量,Foxp3表达量,JAK2表达量,STAT3表达量ED50是加味逍遥丸复方组的0.63倍,0.72倍,0.71倍,0.68倍,0.48倍,0.71倍;以上结果提示配伍地乌对方剂有增效作用。[结论]地乌能增强加味逍遥丸复方治疗皮肌炎,且具有剂量依赖性,可能通过调节免疫防治皮肌炎。3.地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理[目的]探讨地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理。[方法]60只SD大鼠分为对照组,模型组,他克莫司组,加味逍遥丸加地乌复方低中高剂量组;除对照组外,其余动物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42发敏,d63给药二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28开始每日灌胃给药他克莫司(3.12mg·kg-1·d-1)复方低(664.56mg.kg-1·d-1),复方中(2100.00mg·kg-1·d-1),复方高(6636.00mg·kg-1·d-1),d70 处死动物,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE staining)染色观察肌肉病理变化,形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化,形态计量钙化结节体积比;ELISA法检测血清中促炎因子TNF-α,IL-1β的含量;采用免疫组化法测定脾脏CCR2,肌肉和脾脏foxp3表达量,实时定量RT-PCR和Western blot法检测肌肉和脾脏JAK2,STAT3表达水平;免疫组化和Western blot法检测肌肉和脾脏pSTAT3表达水平及其入核比。[结果](1)药效观察:①大体观察:与模型组比,各给药组均不同程度上改善大鼠四肢红肿,肌无力等DM临床表现②病理观察:与模型组比,各给药组明显改善大鼠肌肉组织束周萎缩,肌细胞变性坏死情况,各给药组均能显著抑制T淋巴细胞浸润;③钙化结节体积比:与模型组比,各给药组不同程度地抑制皮下组织钙化结节生成;与FK506比,复方低中高剂量组无差异;④TNF-α:与模型组比,各给药组不同程度减少血清TNF-α水平;⑤IL-1β:与模型组比,各给药组不同程度减少血清IL-1β的释放;与FK506组比,复方中高剂量组无差异。(2)机制初探:①CCR2:脾脏IHC显示,与模型组比,各给药组不同程度降低CCR2原位蛋白表达,其中复方低中高剂量组CCR2原位蛋白表达显著降低,与FK506组比无差异;②JAK2:在肌肉和脾脏组织中,IHC,RT-PCR,Western blot显示,与模型组比,各给药组不同程度下调巨噬细胞 JAK2 基因和蛋白水平③STAT3:在肌肉和脾脏组织中,IHC,RT-PCR,Westem blot显示与模型组比,各给药组不同程度下调巨噬细胞STAT3基因和蛋白表达④pSTAT3入核比:肌肉IHC显示与模型组比,各给药组不同程度降低pSTAT3入核比,复方中剂量显著降低pSTAT3入核,与FK506比无差异。[结论]加味逍遥丸含地乌复方通过下调巨噬细胞JAK2-STAT3通路抑制T细胞增殖活化,恢复免疫平衡防治皮肌炎。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
逡逑图１－２大鼠皮肌炎模型建立技术路线逡逑１．２．３指标检测逡逑（１）症状观察并评分逡逑大鼠在第一次激发后，记录症状并根据其体重，姿势，呼吸，活动等情况，参照逡逑ＬｅｎｎｏｎＶＡ的评分方法进行评分，ｄ６３后开始评分，一周一次。评分标准如表１：（症逡逑１５逡逑
９１逡逑时间（天）逡逑图１－１实验时间进度逡逑４８ＳＤ大鼠；邋１０ＳＤ大鼠逦★提取膜蛋白与完全弗氏佐剂制备膜抗原逡逑逦：逦｜逦逦邋ｉ逦逦逦逡逑ＮＳ，ｓｃ逦ｄ00／ｄ0７／ｄｉ邋４／（＾８逦ＭＡ，ｓｃ逡逑Ｖ邋．逦ｆ逦Ｔ逡逑对照组｜逦Ｉ自身免疫组逡逑ＮＳ，ＳＣ逦ｄ４２／ｄ４９／ｄ５６／ｄ６３逦Ｍ邋Ａ，ｓｃ逡逑逦ｉ逦逦逦%煎义隙哉兆椋危勺陨砻庖咦殄义希危掊五危殄义县裕赫兆椋澹勺陨恚匆咦殄危洌罚峰危筛苹烙脲义希劐澹蝈危蓿掊义希椋纾椋穑螅沐危椋纾椋穑螅沐澹坼澹椋珏危椋疱危螅沐澹椋纾椋穑螅悖掊义希停祝停苠危勺陨砻猓樽椋卞危模龋宰椋疲澹模澹湾澹校停刈椋樽殄义希鲥危慑危慑危卞危卞危剩掊义现副昙觳忮义希ǎ洌纾村危洌梗殄危卞澹洌梗殄危洌皴义希薮财婪皱尾±砑觳殄胃苹樯蚊庖呃嘈湾义希慑危″危危″五五五五澹五五五义贤迹保泊笫笃ぜ⊙啄Ｐ徒⒓际趼废咤义希保玻持副昙觳忮义希ǎ保┲⒆垂鄄觳⑵婪皱义洗笫笤诘谝淮渭し⒑螅锹贾⒆床⒏萜涮逯兀耸疲粑疃惹榭觯握斟义希蹋澹睿睿铮睿郑恋钠婪址椒ń衅婪
本文编号：2793252
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
逡逑图１－２大鼠皮肌炎模型建立技术路线逡逑１．２．３指标检测逡逑（１）症状观察并评分逡逑大鼠在第一次激发后，记录症状并根据其体重，姿势，呼吸，活动等情况，参照逡逑ＬｅｎｎｏｎＶＡ的评分方法进行评分，ｄ６３后开始评分，一周一次。评分标准如表１：（症逡逑１５逡逑
９１逡逑时间（天）逡逑图１－１实验时间进度逡逑４８ＳＤ大鼠；邋１０ＳＤ大鼠逦★提取膜蛋白与完全弗氏佐剂制备膜抗原逡逑逦：逦｜逦逦邋ｉ逦逦逦逡逑ＮＳ，ｓｃ逦ｄ00／ｄ0７／ｄｉ邋４／（＾８逦ＭＡ，ｓｃ逡逑Ｖ邋．逦ｆ逦Ｔ逡逑对照组｜逦Ｉ自身免疫组逡逑ＮＳ，ＳＣ逦ｄ４２／ｄ４９／ｄ５６／ｄ６３逦Ｍ邋Ａ，ｓｃ逡逑逦ｉ逦逦逦%煎义隙哉兆椋危勺陨砻庖咦殄义希危掊五危殄义县裕赫兆椋澹勺陨恚匆咦殄危洌罚峰危筛苹烙脲义希劐澹蝈危蓿掊义希椋纾椋穑螅沐危椋纾椋穑螅沐澹坼澹椋珏危椋疱危螅沐澹椋纾椋穑螅悖掊义希停祝停苠危勺陨砻猓樽椋卞危模龋宰椋疲澹模澹湾澹校停刈椋樽殄义希鲥危慑危慑危卞危卞危剩掊义现副昙觳忮义希ǎ洌纾村危洌梗殄危卞澹洌梗殄危洌皴义希薮财婪皱尾±砑觳殄胃苹樯蚊庖呃嘈湾义希慑危″危危″五五五五澹五五五义贤迹保泊笫笃ぜ⊙啄Ｐ徒⒓际趼废咤义希保玻持副昙觳忮义希ǎ保┲⒆垂鄄觳⑵婪皱义洗笫笤诘谝淮渭し⒑螅锹贾⒆床⒏萜涮逯兀耸疲粑疃惹榭觯握斟义希蹋澹睿睿铮睿郑恋钠婪址椒ń衅婪
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