发汗与非发汗丹参提取物对HepG2细胞及大鼠组织P-gp功能和表达影响的研究

发布时间：2020-08-14 15:17

【摘要】：丹参作为中药中常用大宗中药材,应用极广,能够在心脑血管等多种疾病治疗中起到良好疗效,市场需求量大。但是在中药材市场上,丹参的种质来源混乱,产地初加工及生产加工不一,对于丹参从种植、产地初加工到生产成品的过程中,没有统一规范化的标准进行指导,从而导致市场上的丹参质量不一,甚至出现大量不合格的丹参流通于市场。本文进行发汗与非发汗两种不同炮制工艺下丹参提取物在体内外对于P-gp影响的研究,旨在为丹参的产地初加工提供一定的科学依据。目的:本课题选取人肝癌HepG2细胞研究发汗与非发汗丹参提取物对HepG2细胞内P-gp功能及表达的影响研究,接着进行发汗与非发汗丹参提取物给药大鼠,研究其对大鼠体内肝、肠、脑、肾、心脏P-gp表达影响的研究。方法:体外实验中,MTT实验确定发汗与非发汗丹参总酚酸提取物和丹参酮提取物对于HepG2细胞的最佳给药浓度,接着通过Rho-123实验检测发汗与非发汗丹参提取物对HepG2细胞P-gp功能影响的研究,然后通过RT-PCR和Western blot法进行其发汗与非发汗丹参提取物对于P-gp的mRNA和蛋白表达影响的研究。体内实验,通过给药大鼠发汗与非发汗丹参提取物,采用RT-PCR和Western blot法进行其发汗与非发汗丹参总酚酸提取物和丹参酮提取物对于大鼠肝、肠、脑、肾、心脏P-gp表达影响的研究。结果:采用MTT实验确定发汗与非发汗丹参总酚酸提取物和丹参酮提取物对HepG2细胞的给药浓度:丹酚酸类提取物浓度为20、100、500μg/mL;丹参酮提取物浓度为2、10、50μg/mL。Rho-123实验检测发汗与非发汗丹参总酚酸提取物和丹参酮提取物对HepG2细胞P-gp功能的影响,积累和外排的实验结果表明发汗与非发汗丹参总酚酸提取物类20、100μg/mL对于HepG2细胞P-gp无影响,50μg/mL时有一定的诱导作用,且其发汗要比非发汗丹参总酚酸提取物诱导作用强;发汗与非发汗丹参酮提取物浓度2μg/mL对于HepG2细胞P-gp无影响,当浓度为10、50μg/mL对其HepG2细胞P-gp有抑制作用,且随着浓度的增加,抑制作用更强,同等浓度下其发汗要比非发汗丹参丹参酮提取物抑制作用更强。RT-PCR和Western blot实验结果与Rho-123实验结果基本一致。最后采用RT-PCR和Western blot法进行其发汗与非发汗丹参总酚酸提取物和丹参酮提取物对于大鼠肝、肠、脑、肾、心脏P-gp表达影响的研究,结果表明发汗与非发汗丹参总酚酸提取物对于大鼠肝、肠、脑、肾、心脏P-gp表达无影响,发汗与非发汗丹参酮提取物对于大鼠肝、肠、脑、肾P-gp表达有抑制作用,且发汗要比非发汗丹参丹参酮提取物抑制作用更强;但是对于心脏P-gp表达则无影响。结论:体内外实验表明发汗与非发汗丹参总酚酸提取物正常给药浓度对于其P-gp功能和表达无影响,提高浓度可能对于P-gp功能和表达有诱导作用,且发汗要比非发汗丹参总酚酸提取物诱导作用强。发汗与非发汗丹参酮提取物低浓度对于P-gp功能和表达无影响,正常给药浓度对其有抑制作用,随着浓度的增加,抑制作用更强,且发汗要比非发汗丹参酮提取物对P-gp抑制作用更强。本实验可为丹参的产地初加工提供一定的科学依据,且能够为丹参及其提取物联合使用其抗癌、抗肿瘤等多药耐药药物提供一定的理论基础。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

生长形态,HepG2细胞,完全培养基,孔板

即可加入同体积完全培养基进行终止消化胞完全脱落，吸取细胞混悬液于 15 mL 离心。去除上清液，加入适量完全培养基，轻柔吹养瓶/培养皿/六孔板/96 孔板。放入 37℃、5%的细胞培养至培养瓶 80-90%时，可进行细胞操作，离心后弃去旧的培养基，加入配好的，移入细胞冻存管，旋紧冻存管盖子，用封，随后放入-20℃冰箱放置 2 小时，随后放入罐长期保存。学观察与计数

给药,与非,HepG2细胞,活力

图 2 发汗与非发汗丹参酮提取物给药培养 8、24、48 h 后 HepG2 细胞活力图与空白对照相比，*P <0.05，＃P <0.001。Fig2Activity of HepG2 cells after administration of sweating and non-sweatingtanshinone extract for 8, 24 and 48 hours,Compared with the blank control group,*P <0.05，＃P <0.001.表 2 发汗与非发汗丹参酮提取物给药培养 8、24、48 h 后 HepG2 细胞的存活率（Mean±SD, n=3）Tab2 Survival rate of HepG2 cells after administration of sweating and non-sweatintanshinone extracts for 8, 24 and 48 hours (Mean±SD, n=3)物度HepG2 细胞存活率（100%）NSTN 组 STN 组

丹参提取物,维拉帕米,丹参,与非

图 3 发汗与非发汗丹参提取物对 HepG2 细胞内罗丹明D、E、F、G、H、I、J 分别为空白对照组、维拉帕米酸提取物组、发汗丹参总酚酸提取物组（100 μg/mL）发汗丹参酮提取物组（2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL空白对照组相比，**p<0.01，***Fig3 Effects of sweating and non-sweating salvia miltiorof rhodamine 123 in HepG2 cells. D, E, F, G, H, I, and verapamil inhibitor group, non-sweating and sweating sa(100 μg/mL), non-sweating and sweating tanshinone eμg/mL、50 μg/mL). K is a the resulty statistical analyscontrol group, **p<0.01，***p<

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