何首乌中大黄素活化CYP1A1加重肝损伤机制研究

发布时间：2020-08-15 12:44

【摘要】：目的:何首乌作为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)的干燥块根,最早记载于史书《开宝本草》中;性微温、味苦、甘、涩,临床上应用分为生首乌和制首乌:生何首乌主要用于消痈解毒、润肠通便;而制何首乌则主要用于滋补肝肾、强筋健骨、补精益血、治疗白发。作为何首乌中的主要蒽醌类成分,大黄素在体内分为结合型和游离型两种,其药理学作用广泛,包括抗癌、杀菌消炎等作用,并且对肝癌、肺癌、乳腺癌等治疗作用显著。随着对何首乌广泛使用以及对中药安全性评价和监督的深入,国内外相继出现了关于何首乌致肝肾损伤的临床病例报道,其安全性问题引起了国内外学者的高度关注。目前,普遍认为何首乌的肝损伤作用主要与其所含蒽醌类成分有关,如大黄素、大黄酸对肝细胞的直接毒性作用等。细胞色素P450(CYP)作为人体重要的药物代谢酶,参与90%以上临床药物的代谢,当其活性受到抑制或被诱导时易发生药物相互作用和不良反应,而何首乌致肝毒性与CYP450关系尚未见报道。因此,探讨何首乌对CYP450影响作用,对阐述其毒性作用和机制具有重要意义。本研究将从药物代谢酶角度切入,从体内和体外水平上发现和研究何首乌中大黄素致肝损伤的毒性机制。方法:(1)采用不同剂量大黄素处理L02细胞,MTS法检测细胞存活率从而确定给药浓度,并依次用qRT-PCR及Western-blot技术检测细胞内CYP450亚型的mRNA及蛋白表达。(2)用EMSA凝胶电泳及报告基因技术检测大黄素处理L02细胞后对相关核受体转录因子调控CYP450的影响。(3)siRNA或抑制剂共处理降低细胞内AhR的表达,qRT-PCR及Western-blot检测AhR敲低前后大黄素对L02细胞CYP1A1表达的影响;用Fluo/4-AM荧光探针标记L02细胞,流式细胞术检测CYP1A1敲低前后大黄素对L02胞内Ca~(2+)浓度影响的变化;高内涵检测细胞内GSH、MMP、ROS的影响。(4)整体动物上建立CYP1A1诱导性和抑制性动物模型,检测大黄素在CYP450诱导或抑制的条件下对小鼠肝损伤作用。结果:(1)1~100μM大黄素对L02细胞有不同程度损伤,高浓度下表现出明显的肝细胞毒性作用;(2)大黄素在低(5μM)、中(10μM)、高(20μM)浓度作用于L02时,可剂量依赖性诱导CYP1A1的mRNA及蛋白表达;(3)EMSA、报告基因结果显示,大黄素诱导的CYP1A1表达与其转录因子AhR的激活有关;(4)敲低CYP1A1表达条件下,可逆转大黄素所致的L02细胞凋亡及MMP的下降;(5)大黄素能显著加重CYP1A1诱导型C57小鼠的肝损伤,并增强与内质网应激相关分子ATF-4、CHOP的表达,进一步激活Caspase3而诱导caspase9及其相关凋亡分子的表达。结论:在大黄素影响CYP450各亚型酶作用的筛选过程中,首次发现大黄素呈时间和浓度依赖性诱导CYP1A1、CYP1B1 mRNA和蛋白的表达。进一步证实该诱导效应起始于AhR与CYP1A1调控区的结合阶段,即大黄素能够激活AhR进而增强其对CYP1A1的转录活性。大黄素对CYP1A1的诱导效应是否与何首乌致肝损伤有关,本研究依次从细胞凋亡、高内涵筛选(活性氧、线粒体膜电位、内质网应激)、钙瞬变、western blot技术结合分子生物学验证技术等对与肝毒性密切相关的多项指标结合体内体外实验进行考察。结果表明,大黄素呈剂量依赖性诱导L02肝细胞的凋亡;诱导细胞内内质网应激、降低细胞内线粒体膜电位和GSH的含量;诱导细胞内活性氧的产生和钙离子的累积;同时,我们发现大黄素能激活小鼠肝组织caspase9、caspase3活性进而诱导细胞凋亡。为了验证CYP1A1的诱导与肝毒性的关系,本研究采用相关抑制剂或诱导剂进行比较,发现当大黄素与AhR的特异性抑制剂CH223191共处理时,与未加CH223191相比,细胞活性能显著提高,线粒体膜电位MMP的降低被明显改善,活性氧ROS的产生得到逆转,动物在给予CYP1A1抑制剂后也明显减轻了大黄素所致的肝损伤。根据细胞水平和动物水平实验结果,推测大黄素活化AhR并诱导CYP1A1活性是加重肝损伤的重要原因,其具体机制可能与活化AhR后显著诱导细胞内钙离子累积,持续的氧化应激与内质网应激,进而激活caspase途径诱导细胞凋亡有关;同时大黄素对CYP1A的诱导是否参与了其自身的代谢转化并导致肝毒性也有待进一步深入研究。因此我们认为CYP1A1可能是大黄素加重何首乌肝损伤的重要调控靶点,即大黄素可能通过AhR-CYP1A1通路引起细胞内氧化应激、内质网应激,进而介导细胞凋亡通路导致肝细胞损伤的发生;提示长期使用何首乌诱导CYP1A或与CYP1A诱导性药物(含中药)合用可能具有潜在的肝毒性风险发生。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

何首乌,主要成分,活力,大黄素

Fig. 1-1 Effect of Polygonum multiflorum Thunb on cell viability of L02 cells ( x ± s)图 1-1.何首乌中主要成分对 L02 细胞活力的影响 (x ± s)1.3.2 大黄素对 L02 细胞活力的影响依据上述肝细胞毒性筛选结果，选取 Emodin 为进一步研究对象。以不同浓度度处理 L02 细胞 24 和 48h 后，MTS 方法检测细胞活性，结果表明随着大黄素浓度赖性降低 L02 细胞存活率，给药 48h 细胞存活率较 24h 存活率更低下，说明大黄素细胞毒性同样具有时间依赖性。测定结果采用 GraphPad Prism 5 软件拟合计算 IC(图 1-2)。

大黄素,活力,释放率,细胞损伤

1.3.3 乳酸脱氢酶(LDH)比色法检测 L02 细胞损伤为了检测 Emodin 对 L02 细胞的损伤，用浓度梯度分别处理 L02 细胞 24h 和结果显示处理 24h 后 LDH 释放率无明显变化；而处理 48h 后，随着 Emodin 浓度高，LDH 的释放率逐渐增大(图 1-3)，进一步提示 Emodin 致细胞毒性具有时间和依赖性，与 MTS 结果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)图 1-2 大黄素对 L02 细胞活力的影响 (x ± s)

释放率,大黄素,细胞损伤,细胞活力

脱氢酶(LDH)比色法检测 L02 细胞损伤测 Emodin 对 L02 细胞的损伤，用浓度梯度分别处理 L02 细胞理 24h 后 LDH 释放率无明显变化；而处理 48h 后，随着 Emo释放率逐渐增大(图 1-3)，进一步提示 Emodin 致细胞毒性具有 MTS 结果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)图 1-2 大黄素对 L02 细胞活力的影响 (x ± s)

【参考文献】