牛蒡子苷减轻压力负荷诱导的心肌肥厚及其机制研究

发布时间：2020-08-17 08:51

【摘要】：背景:心肌肥厚是各种心血管疾病导致心力衰竭发生发展的共同病理改变。随着心脏血流动力学长期慢性负荷加重,心脏逐渐发生适应性改变。心肌肥厚作为一种早期代偿机制,引起生理性心肌肥大,而长期的代偿反应最终会引起心脏失代偿,进而发展为心力衰竭,甚至猝死。心肌肥厚是多种综合性因素共同参与调控的复杂过程,包括细胞体积增大、排列紊乱、纤维化及多层次、多通路、多基因的信号传导通路的改变。目前己发现20多个基因的1400多种突变与病理性心肌肥厚发生发展相关,但仍不能全面阐明其机制。大量研究表明,机械性刺激和神经体液刺激均可作为胞外刺激信号诱导心肌细胞内发生一系列信号传导的级联反应,使心肌细胞核内的基因表达发生变化,从而促使心肌细胞肥大或增殖。我们的前期研究结果已经证实丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)和丝/苏氨酸蛋白激酶(Serine-threonine kinase,AKT)是心肌肥厚调控的重要信号分子。MAPKs和AKT信号通路通过活化相关基因参与了心肌肥厚的发病机制,而抑制这些信号通路可以减轻心肌肥厚。因此,设想如果能够使用某种药物阻断这些信号通路,那么就可能找到治疗甚至逆转心肌肥厚与心力衰竭的关键靶点。牛蒡子苷(Arctiin,ARC)是一种从菊科草本植物牛蒡的干燥成熟果实中经过醇提取分离而来的木脂素类化合物,在消化道肠菌和肝脏中儿茶酚-O-甲基转移酶的作用下形成牛蒡子苷元而发挥生物学作用。目前,牛蒡子苷在癌症及糖尿病等方面的研究比较多,而且研究证实其在抗病毒、抗肿瘤、抗增殖、降血脂、治疗高血压等方面也有明显疗效。近年多篇文献报道牛蒡子苷的生物学活性和药理作用主要是通过调控MAPKs、AKT、NF-kB等信号通路发挥作用的。那么,牛蒡子苷对心肌肥厚的发生与发展是否也具有一定的影响呢?经查阅大量相关文献,目前国内外尚未见相关研究报道。本研究基于既往研究的基础,通过建立体内外小鼠心肌肥厚模型,观察分析牛蒡子苷对心肌肥厚的影响,并探讨MAPKs和AKT信号通路在牛蒡子苷作用下对心肌肥厚的作用,进一步阐明牛蒡子苷药理作用的分子机制。目的:探讨牛蒡子苷对C57雄性小鼠经胸主动脉缩窄术(Aortic Banding,AB)诱导的心肌肥厚模型及苯肾上腺素诱导的H9c2心肌肥大细胞的影响及其作用机制,从而为治疗心肌肥厚寻找新的研究方向和治疗方法。方法:将80只周龄在8-10周、体重为23.5-27.5 g的雄性野生型C57 BL/6小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、牛蒡子苷干预的假手术组(ARC+Sham)、AB模型组(AB)、牛蒡子苷干预的AB模型组(ARC+AB),每组各20只。牛蒡子苷干预的实验组(即ARC+Sham与ARC+AB)在AB或假手术后1周给予牛蒡子苷(80毫克/千克/天)连续灌胃4周,对照组(即Sham与AB)给予等量的生理盐水同样灌胃4周。实验结束后处死动物,进行心脏组织取材:依次称取心重(Heart weight,HW)、体重(Body weight,BW),并测量胫骨长度(Tibial length,TL),通过计算心重/体重比(HW/BW)和心重/胫骨长度比(HW/TL)评估心肌肥厚的程度。对心脏病理切片组织行苏木精-伊红染色(HE染色)及天狼星红染色(PSR染色),定量心肌细胞横截面积及心肌纤维化百分比。超声心动图测量各组小鼠左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension,LVESD)、左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、舒张期室间隔厚度(left ventricular septum diastolic,IVSD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWD)和短轴缩短率(Fractional endocardial shortening,FS),评估各组小鼠心脏腔室内径及心脏功能。提取各组小鼠心脏组织中的蛋白及RNA,利用蛋白质印迹法Western Blotting检测心肌组织中MAPKs及AKT信号通路相关蛋白的表达,通过实时定量-PCR(RealTime-PCR)检测心肌肥厚标志分子心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy polypeptide,β-MHC)的mRNA表达。同时检测心肌纤维化相关标志物转化生长因子-1(Transforming growth factor-β 1,TGFβ 1)和 Ⅲ 型溶胶原(Collagen type Ⅲ,Coll Ⅲ)的表达。在体实验采用苯肾上腺素(PE,10 mol/L)诱导体外培养的H9c2心肌细胞构建肥大模型。观察不同浓度(10 μM,25 μM,50 μ M,100 u M)牛蒡子苷对苯肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大的影响,观察H9c2心肌细胞表面积,同时通过Western-Blotting检测MAPKs和AKT信号通路相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,主动脉缩窄术后小鼠心重/体重比、心重/胫骨长度比以及左室心肌细胞横径明显增大(P0.05),心肌纤维结构紊乱及心肌纤维化加重。给予牛蒡子苷干预后,可显著减轻压力负荷诱导的心肌细胞肥大及心肌纤维化,同时改善小鼠心脏功能(P0.05)。通过Western Bloting检测MAPKs和AKT信号通路相关信号分子,以进一步探讨牛蒡子苷减轻心肌肥厚的分子机制。实验结果表明牛蒡子苷可通过抑制MAPKs和AKT信号通路发挥保护作用。在体实验中,苯肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞表面积明显增加(P0.05),Western Bloting检测结果表明肥大的心肌细胞上调了 MAPKs和AKT信号通路的表达(P0.05),而在牛蒡子苷干预后可显著下调上述蛋白的表达。结论:牛蒡子苷可减轻压力负荷及体液因素诱导的心肌肥厚及心肌纤维化,并改善心脏功能。牛蒡子苷是通过抑制MAPKs和AKT信号通路的过度激活而发挥心肌保护作用的。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

心肌肥厚,信号通路

基因应答的重要“信息交流’’环节。在过去的若干年里，研宄人员们一直在试图寻逡逑求心肌肥厚的单一关键靶点，但迄今为止，大量研宄表明，心肌肥厚是与多种信逡逑号传导通路密切相关的（图１）。因此，进一步明确心肌肥厚的分子机制，有助逡逑于完善已有的研究体系，并且有助于寻找阻断甚至逆转心肌肥厚进展至心力衰竭逡逑的治疗手段。已有研宄表明，ＭＡＰＫｓ和ＡＫＴ信号通路是心肌肥厚调控的重要信逡逑号分子［１２，１３］。二者通过活化心肌肥厚的一系列相关基因而发挥调节作用％，１５１。逡逑ＭＡＰＫｓ家族成员主要包括ｐ３８，ｃ－Ｊｕｎ邋Ｎ－末端激酶／应激活化蛋白激酶（ｃ－ｊｕｎ逡逑Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｏｒ邋ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ，ＪＮＫ）和细胞外信号调节激酶逡逑（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅｓ，邋ＥＲＫｓ）。既往文献报道，ＭＡＰＫｓ邋在心肌肥厚逡逑过程中表达上调［１６】，敲除ｐ３８后压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚程度减轻以及过表逡逑达ｐ３８后心肌肥厚程度加重［１７

牛蒡子苷,腔骨,主动脉缩窄,心肌细胞

Ｓｈａｍ逦ＡＢ逡逑图２牛蒡子苷对主动脉缩窄术诱导下心肌肥厚小鼠心脏重量与心肌细胞横截面积的作用逡逑Ａ－Ｂ所示为心重／体重和心重／腔骨长度比值的统计学结果（ｎ邋＝邋２０）。Ｃ为牛蒡子苷作用下逡逑各组对心肌组织影响的组织学结果。Ｄ为心肌细胞横截面积的变化情况（ｎ邋＝邋５）。与逡逑ｓｈａｍ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组相比，＊邋ｐ邋＜０．０５为结果具有显著意义。与ＡＢ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组相比，＃ｐ邋＜０．０５逡逑

牛蒡子苷,心肌肥厚,主动脉缩窄,心脏功能

逑内径（ＬＶＥＤＤ）明显减低（尸＜０．０５），而短轴缩短率（ＦＳ）显著增高（ＰＯ．ＯＳ）逡逑（图３Ａ）。然而，不同干预组的小鼠中心率无明显差别（图３Ｂ）。通过ＲＴ－ＰＣＲ逡逑检测心肌肥厚标志分子ｍＲＮＡ的表达水平，发现主动脉缩窄术后给予牛蒡子苷逡逑治疗的小鼠心房钠尿肽（ＡＮＰ）、ａ－肌球蛋白重链和ｐ－肌球蛋白重链较ＡＢ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑组ｍＲＮＡ表达明显减少（／＞邋＜０．０５），表明牛蒡子苷治疗后心肌肥厚程度减轻，逡逑心脏功能得到改善（Ｐ＜０．０５）（图３Ｃ）。逡逑Ａ邋６］邋口邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逦５0＊｜邋口邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逦７00＊｜邋口邋Ｖｅｈ＾ｌｅ逡逑■邋Ａｒｃｔｉｉｎ邋？逦■邋Ａｒｃｔｉｉｎ逦Ｂ邋６00．邋？邋Ａｒｘｔｉｉｎ逡逑幢＿＿逡逑Ｓｈａｍ逦ＡＢ逦Ｓｈａｍ逦ＡＢ逦Ｓｈａｍ逦ＡＢ逡逑ｃ逡逑？１邋□邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逦？逦｜逦３１邋ＱＶｅｈｉｃｌｅ逦？逦ｃ逦１２邋］邋口邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逦？逡逑｜逦■Ａｒｃｔｉｉｎ逦ｊ逦Ｓ邋■邋Ａｒｃｔｉｉｎ逦ＪＬ逦１逦■邋Ａｒｃｔｉｉｎ逡逑ＩＩ６＇邋ｈ，邋ｒｈ．逦Ｉｆ邋ｅ－逡逑Ｓｈａｍ逦ＡＢ逦Ｓｈａｍ逦ＡＢ逦Ｓｈａｍ逦ＡＢ逡逑图３牛蒡子苷对主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚小鼠心脏功能的影响逡逑Ａ为主动脉缩窄术后４周用心脏超声多普勒评估牛蒡子苷对心肌肥厚的指标变化情况（ｎ邋＝逡逑１５）。Ｂ为各组小鼠心率的变化情况（ｎ＝邋１５）。Ｃ为各组心肌肥厚标志物的ｍＲＮＡ水平变逡逑化情况（ｎ邋＝邋８）。与ｓｈａｍ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组相比，＊邋ｐ邋＜０．０５为结果具有统计学意义。与ＡＢ＋ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑组相比

【参考文献】