岗田酸对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡机制的探究

发布时间：2020-08-17 15:43

【摘要】：宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一。由于种种生物因素和行为因素,使得宫颈癌患病率居高不下。目前,宫颈癌的治疗主要包括手术切除、化学药物治疗和放射治疗。其中,手术切除是最直接有效的治疗手段,但是只适用于没有生育需求、且癌细胞没有扩散的患者。放疗和化疗是重要的辅助治疗手段,但是给病人带来的副作用也十分可怕,导致部分病人因此放弃肿瘤治疗。因此寻找低毒、高效抗肿瘤药物的任务刻不容缓。岗田酸,因其能够有效地选择和抑制磷酸蛋白酶PP1和PP2A,常被用作研究细胞信号通路的有力工具。许多研究表明,岗田酸能够有效抑制某些肿瘤细胞体外增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡。本文选择海洋藻毒素岗田酸,研究其对HeLa细胞增殖、细胞形态和细胞周期的影响;探究其对HeLa细胞凋亡的影响及其机制,包括细胞核形态及DNA、活性氧、线粒体去极化、细胞凋亡和线粒体途径相关酶、蛋白的表达,以期为宫颈癌的治疗和岗田酸的利用提供新的理论依据。结果显示:岗田酸可以在0-120ng/ml浓度范围内抑制HeLa细胞的增殖,抑制率随着时间的延长和剂量的增加而增加;台盼蓝拒染和倒置相差显微镜的观察结果显示,与未加药组相比,随着药物浓度的增加,活细胞数目逐渐减少,细胞形态逐渐趋于圆形。借助流式细胞仪检测细胞周期的结果发现,经岗田酸处理48h后,随着药物浓度的增加,G0/G1期细胞所占比例随药物浓度的增加而减少,由53.92%降低至40.80%;S期所占比例基本不变;G2/M期细胞所占比例增加,由16.39%增长至37.61%,说明岗田酸将HeLa细胞阻滞于G2/M期。Hoechst33258染色检测细胞核形态变化的结果显示,对照组细胞轮廓清晰,保持接触,细胞核形态清晰,细胞完整;加药处理后,细胞核发生边缘化并沿细胞膜分布,部分呈现月牙状,出现凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳结果显示,与对照组相比,加药组中出现梯形条状片段;且随着药物浓度的增加,条带强度与条带数均增加,表明岗田酸处理HeLa细胞后,DNA会发生片段化。荧光分光光度法检测ROS和线粒体膜电位变化,ROS检测结果显示,药物处理后,细胞内ROS含量显著上升,表明岗田酸能够引起HeLa细胞氧化应激的发生;线粒体膜电位检测结果显示,线粒体去极化严重,表明岗田酸能够降低线粒体膜电位。Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的结果显示,与对照组相比,岗田酸处理细胞后,凋亡率随着药物浓度的增加而增加,在50ng/ml和100ng/ml时凋亡率达到56.97%和82.16%,与对照组相比具有显著性差异。该结果表明,岗田酸能够诱导HeLa细胞凋亡的发生。荧光分光光度发检测Caspase-3和Caspase-9酶活性结果显示,与对照组相比,岗田酸处理组细胞Caspase-3、9酶活性随着药物浓度的增加而增加。表明药物处理会激活Caspase-3、9酶的活性,从而引起由Caspase-3、9介导的细胞凋亡发生。Western Blot检测线粒体途径相关蛋白Bax、Bcl-2、Bid和Caspase-3 Western Blot检测结果表明,促凋亡蛋白Bax、Bid和Caspase-3呈上升趋势、抗凋亡蛋白Bcl-2呈下降趋势。该结果说明,岗田酸作用于HeLa细胞后,能够通过依赖于Caspase的线粒体途径诱导凋亡的发生。以上结果表明,岗田酸作用于HeLa细胞后,能够抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G2/M期;岗田酸能够诱导HeLa细胞发生凋亡,可能是通过线粒体途径介导凋亡的发生。
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

相差显微镜,数目,对照组,细胞

图 4-2 岗田酸作用于 HeLa 细胞后细胞数量的变化（n=3）Fig 4-2 The number of HeLa cells under Okadaic acid同一时间与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01示，岗田酸作用于 HeLa 细胞 48h 后，与对照组相比，/ml 降低至 19 万/ml；死细胞数目呈增加趋势，由 21 万活细胞数目和死细胞数目与对照组相比，均具有极显著l 和 100ng/ml 的岗田酸作用于 HeLa 细胞后可以有效抑微镜下观察细胞形态0 10 50 100050100Cellnum******Concentration of OA (ng/ml)

细胞周期阻滞,细胞,酸浓度,酸处理

第四部分实验结果中图 A 所示，不同浓度岗田酸处理 HeLa 细胞 48h 后，随着岗田酸浓度的增加，例减少，由 53.92%降至 40.80%；S 期所占比例基本不变；G2/M 期比例增加，加至 37.61%。由图 4-4 中图 B 可知，50ng/ml 和 100ng/ml 岗田酸作用于 HeLa对照组相比，G2/M 期比例均具有极显著性差异。10ng/ml 岗田酸作用于 HeLa0/G1 期的变化具有显著性差异，50ng/ml 和 100ng/ml 岗田酸作用于 HeLa 细胞期的变化具有极显著性差异。说明，岗田酸将 HeLa 细胞周期阻滞于 G2/M 期。亡途径实验结果hst33258 染色

琼脂糖凝胶电泳,条带,对照组,药物浓度

图 4-6 琼脂糖凝胶电泳观察岗田酸对 HeLa 细胞 DNA 的影响ts of Okadaic acid on HeLa cells through observation by agarose gel el往右条带依次为：Marker、对照组、10ng/ml 、50ng/ml、100ng/，对照组细胞的 DNA 条带为单一、明亮的条带片段，无 DNA 发生片段化，条带呈梯状，高药物浓度组条带亮度变化5000100001500020000***Flourescenceintensity

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