天麻对帕金森小鼠神经元保护作用机制的转录组学分析

发布时间：2020-08-18 11:58

【摘要】：目的:研究天麻对A53Tα-突触核蛋白(α-synuclein)转基因帕金森小鼠的保护作用,并从基因转录组层面探索天麻发挥神经保护作用及其改善帕金森病(Parkinson’s disease,PD)症状的分子机制。方法:1.采用A53T转基因PD小鼠为实验动物,进行小鼠扩增繁殖,通过鼠尾基因型鉴定试验筛选转基因PD阳性小鼠,为后续实验做准备。2.采用4月龄A53T转基因PD小鼠,设置空白组、模型组、阳性组、天麻高(14.4 g·kg~(-1))、中(7.2 g·kg~(-1))、低剂量组(0.72 g·kg~(-1)),连续灌胃给药4周,对小鼠进行爬杆行为学检测、中脑黑质组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、神经元细胞计数。3.通过高通量转录组测序技术构建空白组与模型组、模型组与天麻组小鼠中脑黑质组织的转录组文库,筛选差异表达基因,利用GO、COG、KEGG数据库对差异基因进行功能注释和富集分析,综合分析筛选出天麻保护转基因PD小鼠神经元的关键基因及代谢通路,利用qRT-PCR技术验证候选基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3,NPY,RASGRP1,DRD3的表达丰度。结果:1.繁殖共获得140只离乳小鼠,80雄60雌,经基因型鉴定转基因PD阳性小鼠共74只,其中42雄32雌。2.爬杆行为学结果显示,与空白组相比模型组、阳性组、天麻高、中、低剂量组得分总数差异具统计学意义(P0.05);天麻高、中、低剂量组得分总数均高于模型组且低于空白组,其中天麻中剂量组分数最接近于阳性组,效果最为明显,但与模型组相比无统计学意义(P0.05)。3.HE染色及神经元计数结果显示与空白组相比模型组神经元数量明显减少,差异具统计学意义(P0.05),且形态上可观察到模型组部分神经胞体深染、胶质细胞增生,出现帕金森病症;天麻中剂量组与模型组神经元计数比较差异具统计学意义(P0.05),且天麻中剂量神经元数量接近阳性组,形态上观察到天麻中剂量组残存的黑质神经元较多,细长、深染的神经元的数量较少,而天麻高、低剂量组黑质神经元数量较少。4.经爬杆行为学试验、HE染色及神经元计数结果表明,天麻中剂量(7.2g·kg~(-1))为转基因PD小鼠的最适给药剂量。5.转录测序共获得74.34 Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到7.04 Gb,Q30碱基百分比在85.92%及以上,各样品与参考基因的比对效率从79.70%到86.35%不等,比对效率较高。6.转录组学分析结果表明,空白组比对模型组共筛选出788个差异基因,其中369个基因表达上调,419个差异基因表达下调,差异基因功能注释后分布于215条通路;模型组比对天麻组显示共筛选出466个差异基因,其中292个基因表达上调,174个基因表达下调,差异基因功能注释后分布于177条通路,经GO、KEGG共同富集分析显示模型组中明显激活的为神经活性配体-受体相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信号通路、Ras(大鼠肉瘤原癌基因)通路,与模型组比较关键基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3在天麻组中表达下调,而NPY,RASGRP1,DRD3在天麻组中表达上调,最后经qRT-PCR试验得以验证。结论:1.A53T转基因PD小鼠可较好的模拟帕金森的发病进展,作为PD模型动物应用于研究中较为稳定可靠。2.天麻水煎液可改善A53T转基因PD小鼠的活动能力及中脑黑质神经元病变,特别是天麻中剂量组(7.2 g·kg~(-1))效果较为明显。3.本研究利用转录组测序技术对未给予天麻、给予天麻治疗A53T转基因PD小鼠及空白正常小鼠的中脑黑质组织进行了转录组学分析,结果表明PD发病与神经活性配体-受体相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信号通路、Ras等通路的激活相关,天麻发挥PD保护作用可能与下调c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3等调亡相关基因,上调NPY,RASGRP1,DRD3等神经营养因子及递质相关基因有关,6个候选基因在神经活性配体-受体相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ras通路上富集较为显著,可能为天麻发挥神经保护作用,治疗PD的靶基因。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

电泳图,转基因,小鼠,电泳图

成都中医药大学 2018 届硕士学位论文结果如图 1-1，1-2，1-3 所示（仅选取部分新生小鼠鉴定结果）。图中 M约 250 bp 处可见明显、特异的 PCR 扩增条带，与引物所对应的 Aynuclein 扩增基因片段（248 bp）的预期位置相符，说明出现该特异扩增鼠为转基因 PD 阳性小鼠，未出现该扩增基因片段的小鼠则为转基因 P鼠。图 1-2，1-3 展示了小鼠基因组 DNA 的内参基因β-actin 的扩增结每只新生小鼠在 320 bp 处有明显且特异的扩增条带，说明所提小鼠均较成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鉴定。

电泳图,转基因,小鼠,电泳图

示每只新生小鼠在 320 bp 处有明显且特异的扩增条带，说明所提小鼠 D本均较成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鉴定。图 1-1 A53T α-synuclein 转基因 PD 小鼠目的基因电泳图Fig. 1-1 Electrophoretic figure of the target gene in A53T α-synuclein transgenic PD mic：1~11 表示小鼠编号；K.表示空白组；N.阴性组；M.Marker（DL2000）；TG.目的基

电泳图,基因,内参,电泳图

图 1-3 内参基因基因电泳图Fig. 1-3 Internal gene electrophoretic figure：1~13 表示小鼠编号；K.表示空白组；N.阴性组；M.Marker（DL2000）；Internal cont内参基因.2.2 新生小鼠基因型鉴定结果统计将离乳并存活下来的 140 只健康新生小鼠进行基因型鉴定，基因型汇总见表 1-4，结果表明：140 只离乳新生小鼠中雄性小鼠 80 只，其中阴性小鼠，阳性小鼠 42 只；雌性小鼠 60 只，其中阴性小鼠 28 只，阳性小鼠 32 只表 1-4 新生小鼠基因型汇总表Table 1-4 Genotypic summary of newborn mouse雄性雌性出生月份新生小鼠数量阴性小鼠阳性小鼠阴性小鼠阳性小鼠

【参考文献】