【摘要】：糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最严重的并发症之一,是导致终末期肾脏疾病的主要原因。既往研究多认为DN蛋白尿的出现与肾小球基底膜(GBM)增厚和系膜增生有关,但近年病理学研究证实DN是一种足细胞病,足细胞损伤贯穿了DN的发生和发展全过程,要控制DN蛋白尿的关键在于稳定足细胞形态与功能。研究目的:本研究主要关注于高糖状态下足细胞的凋亡和自噬情况,探讨高糖对足细胞损伤和自噬的影响及固本化瘀通络合剂对足细胞的保护作用,以期为DN提供新的防治靶点。研究方法:选用条件性永生化小鼠足细胞株(Mouse podocyte,MPC5)作为研究对象,运用固本化瘀通络合剂含药血清作用于足细胞,使用正常糖、高糖为干预措施,采用流式细胞术、mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒、免疫荧光、Western Blot、RT-PCR等为检测技术,进行两部分实验。实验一:高糖对足细胞损伤的影响及固本化瘀通络合剂的保护作用分别使用正常血糖(5mmol/L D-葡萄糖)+空白血清、高糖(30mmol/L D-葡萄糖)+空白血清和高糖+含药血清干预培养MPC5 24、48、72h后,通过形态学观察和流式细胞术检测凋亡分析高糖对足细胞损伤的影响及固本化瘀通络合剂对足细胞的保护作用。实验二:高糖对足细胞自噬的影响及固本化瘀通络合剂对自噬的调控作用分别使用正常血糖(5mmol/L D-葡萄糖)+空白血清、高糖(30mmol/L D-葡萄糖)+空白血清和高糖+含药血清干预培养MPC5细胞株24、48、72h后,采用mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒转染和Western Blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、免疫荧光结合Western Blot检测自噬潮(autophagicflux)标志物--p62/SQSTM1、Western Blot检测足细胞自噬相关蛋白(Beclin1)的表达、RT-PCR检测足细胞自噬相关基因(LC3、p62和Beclin1)的表达;以此来分析高糖对肾小球足细胞自噬平衡的干预效应以及固本化瘀通络合剂对足细胞自噬的调控作用。研究结果:实验一:通过细胞形态学观察和流式细胞术检测发现高糖可导致足细胞损伤且诱导凋亡增加;固本化瘀通络合剂对足细胞起保护作用,减少足细胞凋亡发生。实验二:1.1.mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒转染:足细胞的自噬体和自噬溶酶体在高糖刺激下减少;而固本化瘀通络合剂则可增加高糖环境下这两者的数量。2.免疫荧光检测p62水平:高糖导致P62堆积过多,固本化瘀通络合剂可减少P62的堆积。3.Western Blot和RT-PCR检测LC3、P62和Beclin1的蛋白及基因表达水平:高糖环境下足细胞自噬被抑制,自噬降解不畅,表现为LC3、Beclin1的表达减少,P62堆积;固本化瘀通络合剂可改善高糖引起的足细胞自噬抑制状态且自噬流通畅。结论:实验一:高糖可引起足细胞损伤,增加足细胞凋亡;固本化瘀通络合剂可减轻高糖诱导的足细胞损伤,减少足细胞凋亡,对足细胞有一定保护作用。实验二:1.高糖可抑制足细胞自噬,固本化瘀通络合剂对高糖诱导的足细胞自噬水平可相对提高。2.固本化瘀通络合剂或是通过作用于Beclin1调控足细胞自噬水平以减少细胞凋亡。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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