川续断总皂苷抗骨质疏松研究及缓释骨架微丸的制备工艺研究

发布时间：2020-08-21 11:12

【摘要】：川续断为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.ex Henry的干燥根。其主要分布为中国的江西、湖北、湖南、广西、四川等地。因续断可以“续折接骨”而得名。续断性微温,味苦辛,入肝、肾经。秋季采挖,去掉根头和须根,用微火烘至半干,堆置“发汗”至内部变墨绿色时,再烘至近干。川续断化学成分复杂而多样化,主要包括皂苷类(三萜皂苷类)、环烯醚萜类、生物碱类、挥发油类等其他成分。川续断做为骨伤科和妇科常用中药,临床上主要应用于腰膝酸软,风湿痹痛,跌打损伤,崩漏,胎漏。现代药理学证明,川续断具抗骨质疏松、促进骨伤愈合、有抗炎、抗衰老、抗早产、流产、等药理作用。本文以川续断总皂苷和川续断皂苷Ⅵ的含量为评价指标,首先建立两个指标含量测定的方法。供试品加入新配制的5%香草醛-冰醋酸0.4ml,高氯酸1.6ml,密塞摇匀。置于60℃水浴20min后停止反应,取出后立即放入冰水浴中冷却,然后精密加入冰醋酸10ml,摇匀。于540nm处测定其吸光度从而计算川续断总皂苷的含量。实验选定甲醇浓度、超声时间、溶媒比为三个主要因素,以川续断总皂苷的含量与川续断皂苷Ⅵ的含量的综合评分为最终评价指标,设计正交试验,优选了川续断总皂苷的提取工艺,即为加10倍量75%的甲醇超声提取两次,每次30min。验证试验显示三批川续断总皂苷的含量RSD值为1.12%,川续断皂苷Ⅵ的含量RSD值为0.62%,结果表明所得最佳提取工艺简便可行。实验将提取的总皂苷粗提液首先依次用石油醚和水饱和正丁醇萃取,然后考察了D101大孔树脂对总皂苷的纯化工艺,最终确定最佳纯化工艺为:上样浓度0.2g/ml(生药)按2BV/h湿法上样,上样量为1BV,最终用6BV、70%乙醇以1BV/h的流速洗脱。三批验证试验结果总皂苷纯度平均值为59.86%,RSD值0.64%;总皂苷转移率平均值为83.35%,RSD值1.05%,表明确定的最佳工艺稳定,能用于川续断总皂苷的分离纯化。本实验测定了川续断药材中4中目标成分含量,结果川续断皂苷Ⅵ、马钱苷、齐墩果酸和熊果酸的含量平均值依次为66.327、2.240、0.157、0.564 mg/g。实验还建立了70%乙醇洗脱部位的HPLC指纹图谱,结果匹配的峰中有13个共有峰,所有共有峰在20~50min内出峰,峰型基线平稳,各峰能实现良好的分离,10批川续断总皂苷纯化液相似度均大于0.9,表明10批川续断总皂苷纯化液指纹图谱相似度良好,在川续断总皂苷纯化液的质量控制方面具有一定的参考意义。实验考察了川续断总皂苷的抗骨质疏松作用,考察了川续断总皂苷对成骨细胞增值的影响、对ALP活性的影响和OPG及RANKL mRNA表达的影响,结果低中高剂量组对三个指标均表现出一定程度的促进作用。续断总皂苷作用于成骨细胞24、48h,中高剂量组对成骨细胞增殖均有显著性作用(P0.05,P0.01),72h时,中剂量组续断总皂苷对成骨细胞有显著性增殖作用(P0.05);各时间段的低剂量组对成骨细胞也表现出一定的增值作用但并没有显著性差异;与对照组比较,低中高浓度的续断总皂苷对大鼠成骨细胞ALP活性均有促进作用,随着浓度的增加,促进作用增强。其中中高剂量组促进作用具有统计学意义(P0.05,P0.01);续断总皂苷对OPGmRNA的表达有促进作用,低中剂量组促进作用有统计学意义(P0.01);同时续断总皂苷可抑制RANKLmRNA的表达,随着浓度增加其抑制作用增强,且低中高剂量组的抑制作用均有统计学意义(P0.01),OPG/RANKL值升高。实验以总皂苷纯化液干粉为主药,以微晶纤维素、乙基纤维素和硬脂酸为骨架材料,设计了缓释骨架微丸。正交试验优选处方组成为MCC的含量为10%,乙基纤维素与硬脂酸的比例为2:1,释药调节剂乳糖的用量为3%;最佳工艺为:挤出速度为25r/min,滚圆速度为950 r/min,滚圆时间为3min。验证三批微丸的粉体学和体外释放度具有较好的一致性。微丸释药动力学模型拟合结果显示续断总皂苷缓释骨架微丸的释药机制最符合Higuchi方程,说明其释药主要以扩散机制进行。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R283.6
【图文】：

川续断,总皂苷含量,长扫描,全波

图 1 川续断总皂苷含量测定全波长扫描图2.1.4 标准曲线的制备用移液管精密移取 1.0ml 一系列不同浓度的续断皂苷Ⅵ对照品溶（0.1395、0.279、0.4185、0.6975、0.837、1.116、1.395mg/ml）至 2具塞试管中，以不加续断皂苷Ⅵ的试管为对照，按“2.1.3 项下”方法作，于 540nm 波长处测定吸光度，结果如表 1。以浓度为横坐标，吸光为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。表 1 川续断总皂苷含量测定标准曲线编号 1 2 3 4 5 6 7浓度（mg/ml） 0.1395 0.279 0.4185 0.6975 0.837 1.116 1.39吸光度 0.216 0.358 0.491 0.815 0.987 1.303 1.62由上表计算得回归方程为：Y=1.1336X+0.0377，R2=0.9993，表明川断总皂苷在 0.1395～1.395mg/ml 范围内线性关系良好。

曲线,曲线,洗脱液,洗脱剂

图 2 泄露曲线2.4.2.7 洗脱剂用量的考察称取经抽干的 D101 大孔树脂 10g，以一定流速湿法上样，上样量 20ml，上样浓度 0.2g/ml（生药），先用蒸馏水冲洗至无颜色后用 70%的乙醇洗脱，每 10ml 收集一份洗脱液，共收集 20 份。取 1ml 测定各洗脱液的吸光度，计算其总皂苷含量。结果如下表 20，由表中数据可知第 12 份洗脱液以后洗脱液中总皂苷含量极低，确定此时洗脱剂用量为最终洗脱剂用量即120ml。表 20 洗脱剂用量的考察洗脱液编号吸光度/A 川续断总皂苷浓度（mg/ml）1#0.434 3.502#1.077 18.34

川续断,总皂苷

取“2.6.2 项下”10 批川续断总皂苷纯化液，按“2.6.1 项下”色谱条件分别进样，采集 10 批总皂苷纯化液色谱图。将 10 批色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）”进行分析处理。对照图谱以平均数的方法生成，结果匹配的峰中有 13 个共有峰，以 8 号峰为参照峰（用对照品进行标定知 8 号峰为川续断皂苷Ⅵ），S1 为对照图谱 R。1批总皂苷纯化液指纹图谱、共有峰相对峰面积和相对保留时间及相识度评价结果如下图 3、4，表 26、27、28。结果所有共有峰在 20～50min 内出峰，峰型基线平稳，各峰能实现良好的分离，10 批川续断总皂苷纯化液相似度均大于 0.9，表明 10 批川续断总皂苷纯化液指纹图谱相似度良好在川续断总皂苷纯化液的质量控制方面具有一定的参考意义。

【参考文献】