椎间盘退变与椎体骨质疏松的关系及补肾中药对其小鼠模型的干预作用

发布时间：2020-08-21 12:32

【摘要】：目的:1、椎间盘退变和椎体骨质疏松常相互伴随,多见于“肾虚”的中老年人群,是引起脊柱源性疾病一系列临床表现的根源,也是研究的热点和难点。本研究旨在寻找影响椎间盘退变的致病因素,探讨椎体骨质疏松及骨代谢与其的内在联系,明确椎体骨质疏松及骨代谢转换在椎间盘退变中的作用。2、制作动物模型,观察脊柱退变中椎体骨质疏松、终板病变及椎间盘退变的发生情况,对其相关性进一步加以验证;同时,基于TGFβ1-Smad2/3信号通路,观察其是否参与椎体与椎间盘间的骨软骨代谢调控并介导异常的组织结构重塑,探讨椎体骨质疏松与椎间盘退变相互联系和发生发展的分子生物学机制。3、在中医理论体系辨证指导下,运用补肾中药-肾骨安进行干预,观察其是否能调控椎体及椎间盘TGFβ1-Smad2/3信号和微环境,影响骨软骨代谢,改善脊柱退行性疾病中骨与关节微结构和组织病理,为临床运用补肾中药防治椎体骨质疏松和椎间盘退变提供实验基础。方法:1、临床研究腰椎间盘退变与椎体骨质疏松及血清骨代谢水平的关系回顾性收集80例中老年慢性腰痛患者,通过病案管理系统获取其腰椎MRI影像、骨密度(BMD)、骨代谢指标以及病案资料,阅读病历进行筛选、纳入和排除。依据腰椎MRI影像对L1-L4椎间盘退变程度进行Pfirrmann的1-5度分级,根据L1-4椎体骨密度检测结果对骨质疏松程度进行1-4度分级,统计学分析二者严重程度的相关性,统计不同椎间盘退变程度的骨代谢水平,分析其差异性。2、动物实验研究(1)去卵巢及应力失衡条件下椎体、椎间盘的结构和代谢改变40只12周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为4组:正常对照组(CT)、去卵巢组(OVX)、失稳组(SW)、复合模型组(OS),每组10只。每周进行称重,观察小鼠体重变化,造模后12周后取材,观察子宫形态改变并称重。对L4/5节段行Micro-CT扫描,观察椎体骨量、微结构,终板形态和椎间盘体积改变。制作石蜡切片,HE及番红O-固绿染色观察椎体、终板及椎间盘组织病理形态学,免疫组化/免疫荧光检测椎间盘中Ⅰ型胶原蛋白(Col1)、Ⅱ型胶原蛋白(Col2)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达。(2)补肾中药、阿仑膦酸钠及TGFβ抑制剂SB505124对椎体及椎间盘结构的影响75只12周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为5组:正常对照组(CT)、复合模型组(OS)、TGFβ抑制剂组(SB)、阿仑膦酸钠组(ALN)、补肾中药组(HB),每组15只。造模完成后,预防性给药12周,对L4/5节段行Micro-CT扫描,分析检测L4椎体骨量、微结构参数,上下终板体积和孔隙率及L4/5椎间盘的体积。番红O-固绿染色观察椎间盘组织病理学改变。(3)补肾中药对椎体和椎间盘中TGFβ/smad关键信号分子及骨软骨代谢的调控作用动物实验研究第(2)部分中小鼠L4/5节段行Micro-CT扫描后,进行石蜡切片,免疫组化方法检测椎间盘中Col1、Col2、MMP9、CD31、TGFβ、P-Smad2/3表达。Western blot方法分别检测椎间盘中Smad3、P-Smad2/3和VEGF的表达,以及椎体中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、Osterix的表达。结果:1、临床研究中老年慢性腰腿痛患者中多伴有椎体骨量降低或骨质疏松,腰椎间盘退变程度以中度至重度退变为主(Pfirrmann 3级以上),多位于下位腰椎(L4/5节段为主)。椎间盘退变程度与椎体骨质疏松程度具有正相关关系(r=0.459,P0.001),严重的腰椎骨质疏松患者中椎间盘退变的发生率增加,退变的等级升高。同时在椎间盘平均退变水平高的患者中,其血清骨代谢指标(PINP、CTX-1)较退变程度轻的患者明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。2、动物实验研究(1)去卵巢及应力失衡条件下椎体、椎间盘的结构和代谢改变与CT组及SW组相比,OVX可引起小鼠体重明显增加,并出现子宫萎缩(P0.05)。OVX及SW均可引起椎间盘退变的发生,OS导致更为严重的椎间盘退变。Micro-CT结果显示OVX可导致椎体骨质疏松,OVX组及OS组BMDtv及BV/TV、Tb.N、Tb.Th较CT组明显变差(P0.05)。SW可一定程度影响软骨下骨,SW组与CT组比较各参数均无明显差异,(P0.05),但BMDtv有上升趋势;而OS组与OVX组比较BV/TV明显升高(P0.05),且BMDtv、BS/TV、Tb.N有上升趋势,Tb.Sp、SMI有下降趋势。OVX可造成椎间盘终板的骨化重塑,SW可引起终板下骨硬化;与CT组比较,SW组及OS组椎间盘体积均明显降低,OS组下降更为严重(P0.05);OVX组与CT组比较无明显统计学差异(P0.05),但有下降趋势。病理结果显示OVX导致椎体骨小梁稀疏及终板骨化重塑,与micro-CT相符,同时,OVX组及OS组椎体及椎间盘中可见细胞明显减少;SW可导致纤维环结构的破坏、紊乱和融合,以及软骨下骨的应力性改变,OS促使椎间隙的塌陷融合。免疫组化/免疫荧光显示显示OS组、OVX组、SW组与CT组比较,Col2表达均降低,Col1无明显差异,但OVX组及OS组稍高;OVX组及OS组椎间盘中VEGF表达较CT组及SW组明显升高,在终板骨化重塑区尤为明显。(2)补肾中药,阿仑膦酸钠及TGFβ抑制剂SB505124对椎体及椎间盘微结构和病理学的影响Micro-CT结果显示OS组出现明显的骨质疏松和终板病变,椎体BMDtv明显降低(P0.05),各骨微结构参数变差(P0.05),上、下终板体积和孔隙明显增高(P0.05),同时出现椎间盘体积明显降低(P0.05)。与OS组比较,SB、ALN、HB组椎体BMDtv有上升趋势,以ALN组最为明显,同时骨微结构参数均不同程度改善(P0.05),终板的骨化重塑一定程度上得到抑制,其体积缩小,孔隙率降低(P0.05),椎间盘体积增加(P0.05)。病理结果显示,与CT组比较,OS组椎间盘结构形态紊乱,出现严重退变,而与OS组比较,SB组、ALN组及HB组均不同程度延缓了椎间盘退变,改善了椎间盘的组织病理形态。(3)补肾中药对椎体和椎间盘中TGFβ/smad关键信号分子及骨软骨代谢的调控作用免疫组化结果显示,OS组椎间盘中Col1、TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、CD31较CT组均明显升高,而Col2明显降低。与OS组比较,SB组、ALN组和HB组椎间盘中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、CD31较OS组均不同程度下降;SB及ALN对Col2表达无明显影响,但Col1表达降低,而HB组中Col2及Col1表达均明显增加。WB结果显示OS组椎间盘Smad3、P-Smad2/3及VEGF表达较CT组明显升高。而SB组、ALN组、HB组椎间盘中Smad3、P-Smad2/3及VEGF表达均较OS组明显降低,其中,SB组及HB组P-Smad2/3下降明显,说明HB可抑制TGFβ/smad信号的激活。椎体WB结果显示OS组中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9较CT组均明显升高,osterix降低;与OS组比较,SB组TGFβ1明显升高,P-Smad2/3明显降低,可能与通路抑制后机体代偿反应有关,同时其可促使osterix的表达,而MMP9表达无明显改变;ALN组TGFβ1、MMP9明显降低,同时伴随P-smad2/3表达降低,说明抑制破骨可明显抑制TGFβ1的释放,抑制TGFβ/smad信号的激活,其osterix表达未见明显改变,表明ALN对成骨无明显影响。HB组显示TGFβ1下降,同时P-Smad2/3表达显著降低,说明HB具有TGFβ/smad通路的抑制效应,与SB组类似,其osterix表达升高,MMP9表达无明显改变。表明其同时具有成骨效应。结论:1、椎间盘退变与椎体骨质疏松具有正相关关系,骨质疏松可能促使椎间盘退变的发生发展。血清中骨代谢指标水平与椎间退变具有相关性,其在一定程度上具有作为预测椎间盘退变指标的可能。2、去卵巢和应力失衡均能导致小鼠椎间盘退变的发生,二种因素复合情况下会发生更为严重的椎间盘退变。椎体、终板的结构病变和骨软骨代谢异常可能在椎间盘退变中起重要作用,力学和代谢因素的恶性循环可能是导致椎间退变不断进展的原因。同时,椎体骨质疏松引起终板重塑后孔隙的增加及血管新生并不是为椎间盘提供充足的营养,反而促使椎间盘退变,其可能与引起髓核内压缓慢丢失及扰乱椎间盘内环境有关。3、代谢紊乱或者力学刺激导致异常的椎体、终板骨软骨基质转换,释放大量活性TGFβ1激活P-smad2/3介导成-破骨偶联失效及导致组织的纤维化可能是椎体骨质疏松和椎间盘退变发生发展的重要环节。补肾中药可抑制椎体及椎间盘中TGFβ-Smad2/3信号通路,同时改善椎体及终板骨软骨代谢和结构,延缓椎间盘退变,其可能通过调控TGFβ-Smad2/3信号通路而发挥作用。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5;R580;R285.5

【参考文献】