乌头碱调控上皮间充质转化微环境降低肺癌恶性的研究

发布时间：2020-08-23 11:35

【摘要】：肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类健康。临床治疗肺癌的方法有放射治疗、化学治疗、介入治疗、基因治疗等,但肺癌患者的预后仍然很差,中晚期患者5年生存率仅为15%。与肿瘤发病后治疗相比,肿瘤预防无疑是降低肿瘤死亡率最好的办法。之前肿瘤的治疗主要是放在肿瘤自身,近年来越来越多的研究发现肿瘤微环境对肿瘤发生发展同样至关重要,肿瘤微环境为肿瘤的发生发展提供物质和能量。上皮间质转化是肿瘤发生过程中的一个重要特征,其同样受肿瘤微环境的调控。乌头碱具有强心、镇痛、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等药理作用,临床上广泛用于关节疼痛、风寒湿痹、坐骨神经痛等,其镇痛作用强大且不容易耐受。近年来,乌头碱在肿瘤治疗方面的报道也越来越多,一般认为乌头碱通过促进肿瘤细胞凋亡或者增强放化疗效果作用于肿瘤,而在预防与调节肿瘤微环境方面少有报道。本研究的目的是观察细胞上皮间充质转化对乌头碱降低肺癌恶性的贡献,以期为肺癌防治提供新思路。本研究首先对乌拉坦诱导的肺癌模型进行优化,通过比较肺癌发生率、稳定性和平均肿瘤个数,评价造模3次和10次对小鼠肺癌发生率的影响,并比较昆明小鼠、BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠三种品系对乌拉坦诱导肺癌的敏感性;免疫组化法检测小鼠肺组织TTF-1,酶联免疫试剂盒法检测小鼠血浆中CEA含量,确定小鼠肺癌发生。接着观察乌头碱对乌拉坦小鼠肺癌的影响,比较小鼠体重、自主活动、肺脏指数和肿瘤结节数,免疫荧光法检测小鼠肺组织上皮间充质相关蛋白以及小鼠肺组织中干性标志蛋白的表达。为了观察乌头碱对肺癌细胞的影响,我们用MTT法筛选出对LLC细胞10%抑制率的乌头碱浓度,用其处理LLC细胞,两周后,PCNA免疫荧光法检测LLC细胞的恶性增殖能力,Transwell检测侵袭能力,细胞划痕检测迁移能力,软琼脂克隆法、细胞成球法检测LLC细胞自我更新能力,流式细胞术检测肿瘤干细胞标志物Oct-4、NANOG、PCNA的表达量,Western blot检测细胞中上皮间充质相关蛋白和EGF、FGF、HGF、OSM的表达;并在加入乌头碱处理的细胞培养基中分别加入EGF、FGF、HGF、OSM抗体,观察其对乌头碱对LLC细胞恶性作用的影响。最后,我们改变肺癌细胞培养基中的细胞因子水平,加入EGF、FGF、HGF、OSM模拟乌头碱调控LLC细胞上皮间质转化的微环境,观察其与乌头碱是否有相似作用。实验结果表明,腹腔注射乌拉坦600mg/Kg,每周1次,造模10次能够建立发生率达到100%、死亡率低的小鼠肺癌模型,昆明小鼠是最敏感造模小鼠。在小鼠肺癌发生过程中,肺组织TTF-1表达增加,血浆中CEA含量增加。乌头碱治疗乌拉坦小鼠肺癌实验结果表明,乌头碱能够增加肺癌小鼠体重和自主活动,降低肺癌小鼠肺脏指数,减少肺癌小鼠肺部结节数,增加肺癌小鼠E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低Oct-4、NANOG、PCNA的表达量,降低肺癌细胞的恶性。乌头碱处理LLC细胞结果显示,乌头碱在不影响LLC细胞正常增殖的情况下,能够降低LLC细胞的恶性增殖、侵袭、迁移能力,减少软琼脂克隆数和细胞成球数,降低Oct-4、NANOG、PCNA表达,增加E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低LLC细胞恶性,并且增加LLC细胞中EGF、FGF、HGF、OSM表达;而加入EGF、FGF、HGF、OSM中任意一种细胞因子抗体,都会提高LLC细胞的恶性增殖和侵袭能力,上调肺癌细胞上皮间充质过程,增加干性相关蛋白的表达,明显减弱乌头碱降低LLC细胞恶性的作用。最后我们发现,在LLC细胞培养基中加入EGF、FGF、HGF、OSM四种细胞因子能够改变LLC细胞形态,降低LLC细胞的恶性增殖、侵袭、迁移能力,减少软琼脂克隆数和细胞成球数,增加E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低Oct-4、NANOG、PCNA表达量,能够起到和乌头碱相似的作用。综上所述,腹腔注射乌拉坦600mg/Kg,每周1次,造模10次是小鼠肺癌模型的最佳造模方法。乌头碱通过改变细胞因子水平,干预肺癌发生过程中EMT微环境,降低肺癌的恶性,阻止肺癌发展。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

肺部结节,小鼠,重量,死亡率

1 2图 2-1 小鼠肺重量和肺部结节数（X± s，n=30）2.4.2 各组小鼠死亡率和成瘤率统计各组小鼠死亡率和成瘤率发现，3 次注射乌拉坦，昆明小鼠、BALB/C 小鼠、C57/BL 小鼠的死亡率分别为 0，0，5.1%，成瘤率分别为 40.4%，20.4%，9.3%。10 次注射乌拉坦，昆明小鼠、BALB/C 小鼠、C57/BL 小鼠的死亡率分别为 26.1%，29.7%，35.0%，成瘤率均达到 100%。（表 2-1，图 2-2）

小鼠肺癌,发生率

图 2-2 各组小鼠肺癌发生率E 染色结果结果显示，3 次注射的昆明小鼠的肺组织出现明显的瘤区，腺瘤细胞浸润，细胞核密集并且染色比较深；3 次注射的 BALB/C集的瘤区，但是瘤区比较小，能看到腺圈；3 次注射的 C57BL/被肿瘤细胞浸润，并且有炎症渗出。10 次注射的各品系小鼠均有瘤区中间区域甚至出现坏死，腺圈几乎完全消失。（图 2-3）

小鼠,肺组织,免疫组化法,乌拉坦

图 2-3 小鼠肺组织 HE 染色2.4.4 免疫组化法检测小鼠肺组织 TTF-1 结果比较如图 2-4 所示，DAB 染色后，组织上出现的棕黄色、黄色、淡黄色为阳性色。由图可以看出，各品系正常小鼠阳性色很浅甚至无阳性色，腹腔注射乌拉坦的各种品系小鼠均出现不同程度的阳性色；同品系小鼠相比，10 次注射乌拉坦的小鼠均比 3 次注射乌拉坦小鼠 TTF-1 表达量高，其中 10 次注射乌拉坦的昆明小鼠 TTF-1 表达量最高。

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