从“炎症—免疫”网络探索白虎加桂枝汤干预类风湿关节炎的作用机制

发布时间：2020-08-23 14:42

【摘要】：目的本研究针对复杂性疾病类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA),选择临床治疗痹证的经典名方白虎加桂枝汤(Baihu-Guizhi decoction,BHGZD作为研究对象,开展全基因组表达谱芯片检测与网络药理学分析的整合研究,按照“BHGZD化学成分库的建立→候选靶标预测→“疾病基因-药物候选靶标”相互作用网络的建立和分析→BHGZD干预RA的关键网络靶标筛选及作用机制挖掘→实验验证”的研究路线,从“炎症-免疫”网络角度切入,初步鉴定该方的物质基础,揭示该方干预RA的作用机制并筛选其关键靶标。方法1.佐剂诱导性关节炎(Adjuvant-Induced Arthritis,AIA)动物模型的构建及BHGZD干预RA的药效学评价1.1 AIA动物模型的建立选用健康6～7周龄(体重200±20g)的雄性Lewis大鼠,每只大鼠尾根单次皮内注射0.1mL完全弗氏佐剂,建立AIA大鼠模型。1.2动物分组、给药及取材雄性Lewis大鼠54只,随机分为6组,分别为正常对照(Con)组(n=9)、AIA模型组(n=9)、低、中、高BHGZD干预组和甲氨蝶呤(MTX)干预组(n=6/组)。BHGZD三个给药剂量为5.4、10.7、21.4g·kg-1,分别相当于0.5、1、2倍临床等效剂量;甲氨喋呤给药剂量为0.2mg·kg-1,相当于临床等效剂量。大鼠给药容积按照1mL/100g体重灌胃,从免疫当天开始给药,BHGZD干预组每给药6天,间歇1天;甲氨蝶呤每给药3天,间歇1天;Con组和AIA模型组灌服等体积蒸馏水,各组动物给药至造模第25天。第26天处死动物,取关节、肝肾、滑膜等组织按操作要求进行处置。1.3关节炎评价对AIA大鼠关节炎严重程度、疼痛阈值、关节组织病理学变化进行检测和评价,明确该方对RA的干预效果。采用苏木素-伊红(HE)染色法分别对AIA大鼠肝脏组织和肾脏组织进行染色,镜下观察各组大鼠肝、肾受损情况,并计算肝、肾指数。2.全基因组表达谱芯片检测与网络药理学分析的整合研究2.1全基因组表达谱芯片检测及差异表达基因筛选采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit)提取大鼠关节滑膜组织的RNA样本,并用RNeasy mini kit纯化标记后的cRNA。采用全基因组表达谱芯片检测技术(Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K),利用R软件中Limma包对芯片检测原始数据进行归一化,计算基因组间表达量差异倍数(Fold-change)及T检验(Student's t-test),以Fold Change≤0.5或Fold Change≥2,T-test P-value0.05为标准,筛选AIA模型组与Con组大鼠关节滑膜组织之间的差异表达基因,获得AIA病相关基因集。。2.2 BHGZD化学成分库的建立用超高速液相色谱谱飞行时间质谱联用技术(ultra-fast liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry,UFLC-Q-TOF-MS/MS),对BHGZD 水液中化学成分进行鉴定;从台湾中医药资料库TCM Data base@Taiwan获取BHGZD五中药的化学成分信息。2.3 BHGZD所含化学成分的候选靶标预测于课题组前期建立的方法,预测BHGZDD含化学成分的候选靶标。2.4 RA相关分子-BHGZD候选靶标相互作用网络的构建和分析合相关数据库收集的RA相关分子信息及AIA发病相关基因,基于BHGZD所含中药及其相应候选靶标分子的相互作用,建立“RA相关分子-BHGZD候选靶标”相互作网络。算每个节点的网络拓扑特征值(节点连接度、节点介度和节点紧密度);筛选连接度大于所有节点连接度中位值两倍的节点,为网络中的hub节点,并进行直接相互作用络的构建;选取上述拓扑特征值均大于相应中位值的节点,为网络中的关键hub节点。得上述关键网络hub节点所参与的通路信息,通过统计学计算和通路富集分析,选与RA相关的通路。。3.BHGZD对预测信号轴的调控作用验证用蛋白印迹反应(western blot,WB)检测TLR4-c-Fos-IL2--TNF-α信号轴中TLR4(Toll-样受体 4,Toll-like receptor 4)、c-Fos/APP1(原癌基因,Fos proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit)、IL2(白介素2,,interleukin 2)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α,tumor necrosis factor-alpha)在AIA大鼠受累踝关节组织中的表达情况,并利用软件进行据分析。结果1.RA动物模型的成功建立及BHGZD干预RA的药效学评价AIA模型组大鼠红肿、畸形症状显著,即建模成功。BHGZD可有效缓解AIA大鼠关节炎严重程度、缓解疼痛、改善关节组织病理学改变,并在一定剂量范围内(5.4g·kg-1～21.4g·kg-1)呈现剂量依赖性(p0.05、p0.01或p0.001)。AIA大鼠肝、肾组织HE染色结果,尚未观察到AIA大鼠模型建立及BHGZD给药造成的肝、肾损伤等病理变化。2.BHGZD干预RA相关“炎症-免疫”失衡网络的分子机制预测2.1 RA发病相关基因集的筛选基于全基因组表达谱芯片检测技术,得到26个AIA模型组与Con组大鼠关节滑膜组织之间的差异表达基因,其中9个上调基因,17个下调基因。2.2 RA疾病相关基因的收集和整理从Drugbank和KEGG数据库共收集到208个已知RA相关基因,与全基因组表达谱芯片检测所得26个AIA发病相关分子,去冗余后共得234个RA相关基因。2.3 BHGZD所含化学成分库的建立采用UFLC-Q-TOF-MS/MS分析技术,基于化学标准品、色谱行为、离子碎片以及质谱数据库(Natural Products HR-MS/MS Spectral Library)信息共鉴定出41种化合物,其中19种化学成分是依据化学标准品比对鉴定;从台湾中医药资料库TCM Database@Taiwan收集得到的123个BHGZD所含化学成分的二级结构。2.4 BHGZD所含化学成分的候选靶标基于BHGZD化学成分库,通过结构相似性和功能相似性原理,预测得到1312个候选靶标,来自桂枝、甘草、知母、石膏、粳米的预测靶标数目分别为545、701、197、424、266。其中含有53个已知干预RA的相关基因等。2.5 RA相关分子-BHGZD候选靶标相互作用网络的构建和分析基于BHGZD所含中药与其对应候选靶标的相互作用,建立“RA相关分子-BHGZD候选靶标”相互作用网络。基于String数据库,提取上述RA相关分子和BHGZD候选靶标的相互作用信息,并用string interaction score的中位数0.65为卡值,选取大于此卡值的相互作用信息;计算得到623个具有高连接度的hub节点,计算节点连接度、节点介度和节点紧密度,获得177个关键hub节点。在上述关键hub节点中,有39个是已知干预RA的相关基因,其中19个同时为BHGZD的候选靶标,如AGT、CCL5、CD40、CSF2、ESRI1、FOS、IFNG、IKBKB、IL110、IL1B、IL2、IL4、IL6、PPARG、PTGS2、PTK2B、TGFB11、TLR4和TNF。获得上述关键网络节点所参与的通路信息,通过统计学计算和通路富集分析,发现BHGZD干预RA的关键网络靶标显著参与Toll样受体信号通路、B细胞及T细胞受体信号通路、VEGF信号通路等RA“炎症-免疫”失衡相关通路,还显著富集于三条与肪酸代谢相关的通路,脂肪酸合成通路、碳水化合物消化吸收以及脂肪细胞因子信号通路。其中TLR4、c-Fos、IL2与TN F-α四个分子显著富集于Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路,且具有直接相互作用关系。3.BHGZD可抑制RA“炎症-免疫”失衡网络TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信号轴相关蛋白的异常高表达验证实验结果显示,与Con组相比,AIA模型组的大鼠受累踝关节组织中TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α四种蛋白的表达均异常升高(均p0.001),低、中、高剂量BHGZD均可下调此四种蛋白表达水平(p0.05、p0.01或p0.001)。结论1本研究基于AIA大鼠模型,发现BHGZD可显著改善AIA大鼠关节红肿、畸变、疼痛等症状,明确BHGZD对RA的干预效果。2通过开展全基因组表达谱芯片检测和网络药理学分析的整合研究,筛选出显著参与RA“炎症-免疫”失衡网络调节的BHGZD的关键网络靶标,其中包括TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α等显著富集于Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路的关键网络靶标。3通过实验验证表明,BHGZD可能是通过调控“炎症-免疫”失衡网络TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信号轴发挥干预RA的药效作用。4该方的关键网络靶标还显著富集于三条与肪酸代谢相关的通路,这可能与该方的寒药性有关。综上,本研究从“炎症-免疫”网络角度切入,初步揭示BHGZD干预RA的作用机制,为深入阐明该方治痹的科学内涵提供实验依据,为后续“病-证-方”结合研究奠定良好基础。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

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大鼠,关节炎,量化评价指标,肢体

ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋１０．７邋ｇ？ｋｇ－＇逦ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋２１．４邋ｇ．ｋｇ．１逦ＡＩＡ＋ＭＴＸ邋０．２邋ｍｇ．ｋｇ．１逦＇邋１逡逑图２．１．１白虎加桂枝汤对ＡＩＡ大鼠关节的影响逡逑３．２邋ＢＨＧＺＤ千预后可显著改善ＡＩＡ大鼠关节炎严重情况逡逑３．２．１邋ＢＨＧＺＤ可显著缓解ＡＩＡ大鼠关节炎严重程度逡逑（１）疾病严重程度量化评价指标逡逑关节炎临床积分、疾病发病率、首次发病时间及受累肢体累计率是最为直观地反映逡逑疾病严重程度的量化评价指标。实验数据显示，低、中、高不同剂量ＢＨＧＺＤ干预后呈逡逑剂量依赖性改善ＡＩＡ大鼠关节炎的严重程度（图２．１．２），表现为关节炎临床积分、关节逡逑炎发病率及受累肢体累计率的下降，首次发病时间的延长。数据表明，ＡＩＡ模型组的关逡逑节临床积分最高为３４分，发病率为９４％，首次发病时间为第１１天，受累肢体累计率为逡逑７３％邋（附录表１－４）。逡逑

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图２．１．２白虎加桂枝汤对ＡＩＡ大鼠关节炎严重程度的影响逡逑（Ａ）各组大鼠关节临床积分：（Ｂ）各组大鼠关节炎发病率；（Ｃ）各组大鼠关节炎首次发病时间；（Ｄ）各组大鼠受逡逑累肢体累计率（数据为均数±标准差农示与正常对照组相比，ｐ＜０．０１，＿？＜０．００丨：“＊”，“＊＊”，“＊＊＊”及逡逑示与邋ＡＩＡ邋模型组相比，／７＜０．０５，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１邋）逡逑①关节临床积分：ＡＩＡ模型组大鼠的关节临床积分为３４，低、中、高剂量ＢＨＧＺＤ干预逡逑后均可显著降低关节临床积分（＾＜０．０５、产０．０１或ｐ＜０．００１），其中高剂量ＢＨＧＺＤ的效逡逑果最为显著（图２．１．２八，／？＜０．００１）；逡逑②关节炎发病率：ＡＩＡ模型组大鼠关节炎发病率高达９４％，中、高剂量ＢＨＧＺＤ干预后逡逑关节炎发病率均显著降低（均ｐ＜0．0５），分别为７８％、６７％，低剂量ＢＨＧＺＤ疗效稍差逡逑（图邋２．１．２Ｂ）；逡逑③首次发病时间：ＡＩＡ模型组大鼠关节炎首次发病时间为造模第１１天，低、中、高剂逡逑量ＢＨＧＺＤ干预后可延长关节炎首次发病时间（ｐ＜０．０５或／７＜０．００１），至造模第１２天，逡逑其中高剂量药效最佳，效果与阳性药ＭＴＸ相似（图２．１．２Ｃ）；逡逑④受累肢体累计率：ＡＩＡ模型组大鼠的受累肢体累计率为７３％，低、中、高剂量ＢＨＧＺＤ逡逑

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