融合表达bFGF蛋白的亚麻芥油体冻干粉的稳定性和安全性研究

发布时间：2020-08-23 15:30

【摘要】：众所周知,bFGF对创伤修复领域的研究具有非常重要的意义,因其能够有效地促进伤口的愈合以及抑制瘢痕的形成,使其在医疗、美容领域具有良好的开发前景。但是目前市售的bFGF生长因子多数为原核及酵母系统表达,导致bFGF分离纯化成本高,蛋白不稳定,一旦溶解在溶液中,就必须储存在低温条件下(4℃),并在2周内使用完毕,不易保存。因此,开发bFGF新型表达纯化系统,改良bFGF的药物剂型,使其在室温条件下储存更加稳定具有重要的意义。本实验室选用植物油体作为bFGF的表达载体,分离纯化方法简单易操作。并选用冻干粉作为药物剂型,能够有效地延长产品的存储时间,方便产品的运输及储存,有效地降低了bFGF产品的生产和运输成本。为进一步确定融合表达bFGF蛋白的亚麻芥油体冻干粉(oleosin-bFGF)的稳定性和皮肤给药毒性,为后续oleosin-bFGF冻干粉产品的开发、质量和安全标准体系的建立奠定基础。本研究通过对oleosin-bFGF冻干粉的影响因素、加速稳定性和长期稳定性进行考察,确定其存储条件及存储时间;其次通过初步研究oleosin-bFGF冻干粉的急性和亚慢性皮肤给药毒性,对其进行药物安全性评价。主要研究结果如下:1.通过检测在60℃高温、高湿度及强光光照条件下放置的oleosin-bFGF冻干粉的各项指标发现,oleosin-bFGF冻干粉在高温、高湿条件下外观、镜检、pH值、蛋白含量以及促细胞增殖活性呈较明显的下降趋势;光照条件下以上检测指标变化不明显。说明oleosin-bFGF冻干粉主要在高温和高湿度环境下不稳定,因此oleosin-bFGF冻干粉在储存运输过程中应避免40℃以上高温,并采用真空密封包装,2.经加速稳定性实验(6个月)和长期稳定性实验(12个月),验证oleosin-bFGF冻干粉的外观,镜检,pH值,蛋白含量,促细胞增殖效果以及无菌检测结果均未发生明显变化。说明其常温稳定性良好,打破市售bFGF冻干粉只能低温保存的局限性。3.通过对大鼠一次性皮肤给药发现,即使是高剂量的oleosin-bFGF冻干粉对大鼠也无明显影响,所有大鼠均未出现中毒迹象,实验组大鼠活跃度正常,几乎没有可察觉的红斑及水肿。对实验组和对照组的体重变化及脏体比进行统计学分析无显著差异,oleosin-bFGF冻干粉的最大耐受剂量为2000 mg/kg。4.对大鼠连续皮肤给药28天发现,即使是持续给药的条件下,oleosin-bFGF冻干粉对大鼠的一般状态,体重变化,血常规及血液生化指标,脏器系数,组织病理学检查均无明显影响,所有大鼠均没有中毒迹象发生。说明oleosin-bFGF冻干粉皮肤给药安全性良好,符合OECD准则的要求,值得进一步研发推广。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6
【图文】：

的人工气候箱内放置 12 个月。所用设备应能控制相对湿度在±5能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间的第 3 个月、第 6 个月月末分别取样一次（每 3 个月检测一次，每次随机取样 5 瓶），对 ol外观、显微镜结构、pH 值变化、oleosin-bFGF 油体蛋白含量、微生物对其促细胞的增殖活性进行分析，并与培养 0 天的 oleosin-bFGF 冻干查结果进行比较分析，观察各项指标在不同时间的变化情况GF 冻干粉在常温条件下的稳定性，借以确定 oleosin-bFGF 冻干粉与分析佳预冻条件预冻温度筛选结果察预冻温度分别-20℃，-40℃，-80℃，预冻时间为 12 h，生产的 ol发现当预冻温度为-80℃时，oleosin-bFGF 冻干粉的冻干效果最好，没发生，颜色也较为白皙。而且从 oleosin-bFGF 冻干粉的油体蛋白显微预冻温度为-80℃时，oleosin-bFGF 冻干粉的油体蛋白破裂融合数目油体蛋白破裂融合现象（图 2-1）。-20℃ -40℃ -80℃

（2）最佳预冻时间筛选结果根据 oleosin-bFGF 冻干粉的最佳预冻温度筛选结果（最佳预冻温度为-80℃），筛选oleosin-bFGF 冻干粉的最佳预冻时间，发现当预冻时间为 10 h，11 h 的 oleosin-bFGF 冻干粉的冻干效果是最好的，从其外观可以看出，当预冻时间为 10 h，11 h 时，oleosin-bFGF冻干粉没有气泡和喷瓶现象，颜色相对其他预冻时间也较为白皙。而且预冻时间为 10 h11 h 时的 oleosin-bFGF 冻干粉的镜检结果也更好，相比于其他预冻时间，油体蛋白破裂融合数目较少，油体蛋白分布更加均匀（图 2-2）。1 h 2 h 3 h 4 h

oleosin-bFGF 冻干粉油体蛋白出现明显的破裂、聚集现象（图 2-3）并开始出现断裂、结块等现象，pH 值明显下降，复溶性也开始变慢（leosin-bFGF 冻干粉内的 oleosin-bFGF 含量逐渐变低（图 2-4、2-5），ole细胞增殖效果明显减弱，生物活性降低（图 2-6）。所述，说明温度对于 oleosin-bFGF 冻干粉的油体蛋白有一定的影响，结构发生破坏，进而对其稳定性造成影响。因此，本实验建议 oleosi输及存储过程中应该尽量避免 40℃高温环境对其造成影响。表 2-1 高温条件下放置不同时间的产品性状Table 2-1 Product changed at different duration under high temperature condition时间/d 外观 pH 值 复溶性 Oleosin-bFGF 的0 白色，疏松 7.51 快 0.2145 白色，结块 7.38 较慢 0.1860 米黄色，结块 7.21 慢 0.1120 d 5 d 10 d

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本文编号：2801693