白藜芦醇对潜伏HIV的激活效应及其机制研究

发布时间：2020-09-01 15:18

　　高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)的应用成功地将艾滋病从一种致死性的疾病转变为一种慢性可控性的疾病。然而由于患者体内潜伏HIV储存库的存在,一旦停药,患者体内的HIV病毒载量又会迅速反弹。“激活再杀灭”治疗策略的提出希望通过潜伏激活剂特异性地激活潜伏储存库中的HIV,同时再联合HAART阻止病毒的二次感染;活化的HIV可诱导细胞病变效应和天然免疫系统对细胞特异性杀伤,最终实现艾滋病的功能性治愈。目前,高效低毒的潜伏激活剂的开发是艾滋病治愈研究的热点。白藜芦醇是一种广泛存在于多种植物中的天然化合物,尤其在红酒中含量较为丰富。在之前的研究中发现白藜芦醇能够激活潜伏HIV,但是对它的激活作用以及作用机制还没有深入的研究。因此,本研究通过流式细胞术、荧光定量PCR以及Western blotting等实验手段对白藜芦醇激活潜伏HIV的活性进行了验证,并在此基础上以J-LatA2细胞为主要实验对象进一步阐明其作用机制。本研究首先采用多株HIV潜伏感染细胞(J-Lat A2、J-Lat 10.6和ACH2细胞)对白藜芦醇激活潜伏HIV的能力进行了验证。随后通过XTT法检测白藜芦醇对三株HIV潜伏感染细胞、Jurkat T细胞以及人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)细胞活力的影响,结果显示白藜芦醇具有较小的细胞毒性。为进一步分析白藜芦醇的安全性,检测其是否能引起广泛的T细胞活化。结果表明白藜芦醇并不影响人PBMCs中T细胞活化标志CD25和CD69的表达,提示白藜芦醇并不会引起广泛的T细胞活化。此外,当联合使用白藜芦醇和经典激活剂prostratin、JQ1以及SAHA后发现白藜芦醇与此三个经典激活剂合用对潜伏HIV均具有协同激活效应。在白藜芦醇具有潜伏HIV的激活活性的基础上,本研究还进一步检测了白藜芦醇衍生物(三乙酰白藜芦醇、二氢白藜芦醇、白藜芦醇三甲醚、白皮杉醇、紫檀芪和虎杖苷)对J-Lat A2细胞中潜伏HIV的激活效应。结果表明仅有三乙酰白藜芦醇仍具有与白藜芦醇相似的活性,并且与prostratin、JQ1、SAHA也具有协同作用。而其他五个衍生物对潜伏HIV无明显的激活作用。通过构效分析推测白藜芦醇结构中苯环上的间位羟基和两个苯环之间的双键对于白藜芦醇发挥激活潜伏HIV的活性可能比较关键。在进一步的机制研究中,采用Western blotting、流式细胞术、染色质共沉淀等多种实验方法得出白藜芦醇可能的作用机制:白藜芦醇诱导的潜伏HIV激活作用与SIRT1无关。其可能是通过上调组蛋白乙酰化水平、活化热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)通路以及P-TEFb共同促进转录起始和转录延伸,进而促进潜伏HIV的激活。综上所述,白藜芦醇能够有效地激活潜伏HIV,同时不引起广泛的T细胞活化。而这一激活作用可能是通过上调组蛋白乙酰化水平、活化HSF1通路以及P-TEFb而产生的。此外,白藜芦醇与经典潜伏激活剂prostratin、JQ1和SAHA具有协同激活的作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

示意图,策略,示意图,二次感染

毒的二次感染；同时活化的ＨＩＶ可诱导细胞病变效应和天然免疫系统对细胞特异逡逑性杀伤，使得潜伏细胞半衰期大大缩短进而迅速走向死亡；最终实现ＨＩＶ的功能逡逑性治愈［２７］（图１）。逡逑ｊ）ＮＡ逦Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ逦Ｉｍｍｕｎｅ邋ｓｙｓｔｅｍ逦Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ逡逑＇Ｄ邋－邋＾Ｌｒ逡逑Ｈ｜Ｖ逦Ｍｅｍｏｒｙ逦厂逦｜逡逑ｇｅｎｏｍｅ邋ＣＤ４’Ｔ邋ｃｅｌｌ逦ＨＩＶ邋ＲＮＡ邋ＨＩＶ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逦Ｄｙｉｎｇ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｃｅｌｌ逦Ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｃｅｌｌ逡逑图１：逦“激活再杀灭”策略示意图［２７］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１：邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋“ｓｈｏｃｋ邋ａｎｄ邋ｋｉｌｌ”邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑四潜伏激活剂的研宄进展逡逑针对已发现的ＨＩＶ潜伏感染形成和维持的机制，目前已发现多个作用于不逡逑同途径的潜伏激活剂。主要分为以下三大类：逡逑１．表观遗传修饰类潜伏激活剂：包括ＨＤＡＣ抑制剂（ＨＤＡＣ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，邋ＨＤＡＣｉ），逡逑可抑制组蛋白去乙酰化酶，使染色体中的结构单元核小体趋于不稳定状态，从逡逑４逡逑

途径,抑制剂,药物,甲基化转移酶

称为ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、帕比司他、罗米地辛［２８］。ＤＮＡ甲基化酶（ＤＮＡ邋ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，逡逑ＤＮＭＴ）抑制剂，可抑制前病毒ＤＮＡ的甲基化过程。代表药物有地西他宾［２９】。逡逑组蛋白甲基转移酶（Ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＨＭＴ）抑制剂，可抑制细胞ＨＭＴ的活性，从而抑制前病毒ＤＮＡ的转录。代表药物有Ｇ９ａ甲基化转移酶抑制剂逡逑ＢＩＸ０１２９４和Ｓｕｖ３９Ｈｌ甲基化转移酶抑制剂毛壳素。逡逑２．转录因子类潜伏激活剂：包括蛋白激酶Ｃ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋Ｃ，邋ＰＫＣ）激活剂，逡逑可磷酸化ＰＫＣ，进而活化下游ＮＦ－ｋＢ以及ＡＰ－１通路，促进ＨＩＶ基因的转录。代药物有？１＾加如、卩＼１八以及１＾（＾３如－１［３（），３１］。卩－丁￡？１５激活剂，通过促进？－丁丑？与ＨＩＶＴａｔ结合激活ＨＩＶ的转录。代表药物有ＨＭＢＡ、ＪＱ１和ＯＴＸ０１５等［３２＿３４］。逡逑３．细胞因子免疫功能调节剂：如ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５和ＧＭ－ＣＳＦ等［３５］。另外还有未逡逑分类型的戒酒硫（ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ）邋［３６］，维甲酸（ａｃｉｔｒｅｔｉｎ）等［３７］。在目前己有的研究逡逑结果表明，联合应用两种或两种以上不同作用机制的ＬＲＡｓ，能发挥协同增强的逡逑激活活性［１６，３８］。各类ＬＲＡｓ的作用途径如图２所示。逡逑

白藜芦醇,反式,化学结构

上的植物中。白藜芦醇在植物中能以游离态（顺式、反式）和糖苷结合态（顺逡逑式、反式）两种形式分布。在植物中白藜芦醇主要以反式形式存在，并且其生逡逑理活性强于其顺式异构体％】。反式白藜芦醇的化学结构式如图３所示。逡逑ＨＯ逡逑ＨＯ逡逑图３：反式白藜芦醇的化学结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３：邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓ－ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ逡逑自２０世纪９０年代发现葡萄酒的饮用进而摄入白藜芦醇可减低冠心病的发逡逑病率起，白藜芦醇就受到广泛的关注，其生物活性也得到了进一步的开发【４１］。逡逑近年来，越来越多的研宄表明白藜芦醇具有抗癌、心血管保护、抗炎、神经保逡逑护等多种生物活性及药理作用［４２］。现如今，己有超过１２０个临床试验被批准用逡逑于确定白藜芦醇的安全性及其多种药理作用。其中有６个处于ＩＶ期临床试验阶逡逑段［４３］。在ＨＩＶ研宄领域，白藜芦醇也被报道具有抗病毒活性。其作用机制是通逡逑过抑制核糖核苷还原酶的作用从而抑制核糖核苷酸的生成，进而抑制ＨＩＶ的复逡逑６逡逑

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