人参倍半萜有效部位药理活性及作用机理研究

发布时间：2020-09-02 13:01

　　目前,关于人参的研究主要集中在皂苷、蛋白质和多糖等水溶性成分和活性方面,而对其脂溶性部位的研究较少。课题组对人参脂溶性成分中的倍半萜化合物进行了研究,建立了人参倍半萜有效部位(Sesquiterpenoids of Panax Ginseng SPG)的提取分离方法,并对其抗抑郁和抗急性肝损伤药理活性和作用机理开展了实验研究。主要研究内容及结果如下:1、SPG提取方法的建立和成分分析本文利用超临界CO_2萃取系统将人参中挥发油进行提取,通过水蒸气蒸馏法对挥发油中的倍半萜成分进行精致,收集170-350 min时间段的馏分,即SPG。利用气-质联用技术(GC-MS)对SPG的成分进行分析,鉴定出共有21种结构。2、SPG抗抑郁机制的研究利用脂多糖(LPS)诱导小鼠抑郁模型,探究SPG抗抑郁活性及作用机制。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予SPG(0.25和1 mg/kg)7天,并在最后一天给予SPG 1小时后腹腔内注射LPS(0.5 mg/kg)。在LPS给药24h后进行行为学实验,行为学实验结束后获取小鼠血清和海马。根据试剂盒说明书测定血清和海马组织中相关指标。同时通过检测海马组织western-blot结果来分析SPG抗抑郁作用机制。结果表明,与LPS模型组相比,SPG有效地减少了小鼠在悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)中的不动时间;SPG显著降低了血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量。此外Western-blot检测结果显示,SPG上调了脑源性神经营养因子(BDNF),原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)和sirtuin 1型(Sirt1)的表达,下调了核因子-κB(NF-κB)和κB-α抑制剂(IκB-α)的表达。综上所述,SPG(0.25和1 mg/kg)有明显的抗抑郁作用,其作用机制与抑制海马炎症,增加氧化应激和神经营养因子有关。3、SPG抗急性肝损伤机制的研究通过三种不同的急性肝损伤模型,包括四氯化碳(CCl_4)模型、D-氨基半乳糖(D-GalN)/LPS模型和对乙酰氨基酚(APAP)模型来探究SPG对急性肝损伤的保护作用及机制。(1)CCl_4急性肝损伤模型的建立。利用CCl_4急性肝损伤模型,探究SPG保护CCl_4诱导的急性肝损伤药理活性及其作用机制。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予SPG(2.5和10mg/kg)7天,并在最后一天给予SPG 1小时后腹腔注射CCl_4(0.2%)。在CCl_4给药24h后,收集小鼠的血清和肝脏。根据试剂盒说明书测定血清和肝组织中相关指标;利用HE染色、western-blot、RT-PCR等结果来分析SPG保护CCl_4诱导急性肝损伤的机制。结果表明,与CCl_4模型组相比,SPG显著降低了血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、TNF-α、IL-6和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;提高了肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的含量,降低了丙二醛(MDA)的含量。另外,从HE染色分析中发现SPG能够明显改善CCl_4诱导的肝脏细胞凋亡,炎症浸润的现象。此外,western-blot检测结果表明SPG下调了CCl_4诱导的c-Jun N末端激酶(p-JNK)、细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、p-p38、NF-κBp65和环加氧酶-2(COX-2)蛋白的表达;RT-PCR检测结果表明SPG下调了CCl_4诱导的TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的水平。综上所述,SPG(2.5和10 mg/kg)明显的保护了CCl_4诱导的急性肝损伤,其作用机制与其抗氧化和抗炎能力有关。(2)D-GalN/LPS急性肝损伤模型的建立。利用D-GalN/LPS急性肝损伤模型,探究SPG保护D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤药理活性及其作用机制。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予SPG(2.5和10 mg/kg)7天,并在最后一天给予SPG 1小时后腹腔内注射LPS(25μg/kg)和D-GalN(400 mg/kg)。在D-GalN/LPS给药24h后,收集小鼠的血清和肝脏。根据试剂盒说明书测定血清和肝组织中相关指标;利用HE染色、western-blot、RT-PCR等结果来分析SPG保护D-GalN/LPS诱导急性肝损伤的机制。结果表明,与D-GalN/LPS模型组相比,SPG显著降低了血清中AST、ALT、TNF-α和IL-1β的含量;提高了肝脏组织中GSH、CAT和SOD的含量,降低了MDA的水平。另外,SPG能够减轻D-GalN/LPS诱导的肝脏组织病理损伤。此外,western-blot检测结果表明SPG上调了D-GalN/LPS诱导的血红素加氧酶-1(HO-1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)和Sirt1蛋白的表达,下调了NF-κBp65和IκB蛋白的表达。同时,RT-PCR检测结果表明SPG下调了D-GalN/LPS诱导的TNF-α和IL-1βmRNA的水平。综上所述,SPG(2.5和10 mg/kg)明显的保护了D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤,其作用机制与与其抗氧化和抗炎症能力有关。(3)APAP急性肝损伤模型的建立。利用APAP急性肝损伤小鼠模型,探究SPG保护APAP诱导的急性肝损伤药理活性。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予SPG(2.5和10 mg/kg)7天,并在最后一天给予SPG 1小时后腹腔内注射APAP(300 mg/kg)。在APAP给药24h后,收集小鼠的血清和肝脏。根据试剂盒说明书测定血清中ALT和AST的含量。结果表明,与APAP模型组相比,SPG预处理组血清中ALT和AST的含量没有明显的显著性差异。因此,SPG(2.5和10 mg/kg)对APAP诱导的急性肝损伤没有明显的保护作用。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

倍半萜化合物,总离子流,比较鉴定,倍半萜类化合物

国国家标准与技术研究院（NIST05）质谱库比较鉴定化合物的质谱，并用 G2070BAGC化学工作站 B.01.01 进行了峰面积的测量和数据处理。确定 SPG 中有 21 种倍半萜类化合物，占总量的 66％，结果详见图 1-2、表 1-1。

小鼠,血清,神经疾病,抑郁症

图 2.1 SPG 对小鼠 TST 和 FST 不动时间的影响Fig.2.1 Effects of SPG on the immobility time in the TST and FST注：所有数据均表示为为x ±s (n=10)，与对照组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与 LPS 组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。All data were expressed as x ±s (n=10). Compared with control group:#P<0.05,##P<0.01,###P<0.0Compared with LPS group: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.2.3.2 SPG 对血清促炎细胞因子水平的影响炎症被认为是神经疾病（包括抑郁症）潜在的病理生理学机制。如表 2-2、图 2.2示，与对照组相比，LPS 组中 TNF-α 和 IL-6 的水平显著增加（#P<0.05,##P<0.01）。同时与 LPS 组相比，FLU（20 mg/kg，i.p.）和 SPG（0.25 和 1 mg/kg，i.g.）预处理显著降低血清 TNF-α 和 IL-6 的水平（P<0.01）。由此表明，SPG 保护 LPS 诱导的抑郁可能与抗作用有关。表 2-2 SPG 对血清中 TNF-α 和 IL-6 水平的影响Tab.2-2 Effect of SPG on serum levels of TNF-α and IL-6

蛋白表达,抗抑郁作用,抗抑郁药物

图 2.3 SPG 对 BDNF、TrkB、Sirt 1、IκB-α 和 NF-κB 蛋白表达的影响Fig.2.3 Effect of SPG on the expression of BDNF、TrkB、Sirt 1、IκB-α and NF-κB注：所有数据均表示为为x ±s (n=3)，与对照组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与 LPS 组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。All data were expressed as x ±s (n=3). Compared with control group:#P<0.05,##P<0.01,###P<0.00Compared with LPS group: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.2.4 讨论本课题组以前的研究表明，SPG 通过修饰多巴胺能系统、GABA 能系统和谷氨酸能系统表现出显著的抗抑郁作用[101]，但其抗抑郁作用的潜在机制尚未明确。大量研究表明，抗抑郁药物对抑郁症的神经保护作用大多归因于其对炎症和氧化应激的有效作用。LPS 能够有效的诱导小鼠抑郁模型，可用于筛选抗抑郁药物并研究其作用机制[106]。因此，本章节的目的是检验SPG的抗抑郁活性，并探讨其在LPS诱导的小鼠抑郁模型中的作用机理。抑郁症的发生常伴有免疫系统的激活，细胞因子分泌的增加；同样，细胞因子分泌的增加也可能引起个体情绪和行为的改变。近来研究表明，促炎细胞因子与抑郁症的发生有着紧密的联系[107, 108]。在本研究中，SPG 预处理显著降低了 IL-6 和 TNF-α 的水平，这表

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