狭山野豌豆化学成分及免疫活性研究
发布时间:2020-09-02 13:36
狭山野豌豆为豆科野豌豆属植物(V.amoena Fisch.var.Angusta.Freyn),味甘、性平,具有活血、解毒、通络、行水的功效,为蒙药透骨草山野豌豆的变种,在民间亦作为透骨草被广为使用。临床上多用于祛风除湿,活血止痛等病症,属于舒筋活络型祛风湿药。目前,关于狭山野豌豆化学成分、生物活性的报道屈指可数。因此本课题组对狭山野豌豆水提液乙酸乙酯层及多糖进行化学分离,得到单体化合物和通过乙醇沉淀得到的不同多糖部位,并对单体化合物和不同多糖部位进行免疫活性研究,考察了狭山野豌豆单体化合物和多糖对巨噬细胞NO释放量、吞噬中性红能力、迁移能力和对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,具体方法和结果如下:1、狭山野豌豆单体化合物提取分离利用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱层析、制备型TLC以及HPLC等分离纯化方法,对狭山野豌豆水提取物的乙酸乙酯层进行化学分离,得到18个单体化合物,根据理化性质和波谱数据鉴定了17个化合物的结构,分别为山柰酚(1)、槲皮素(2)、苜蓿素(3)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(5)、槲皮苷(6)、异槲皮苷(7)、山柰苷(8)、汉黄芩素(9)、金丝桃苷(10)、杨梅苷(11)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(12)、山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷(13)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖(14)、绿原酸(15)、胡萝卜苷(16)、β-谷甾醇(17)。其中化合物12-14为首次从狭山野豌豆中分离得到。2、狭山野豌豆多糖的制备与分离(1)酶解法提取狭山野豌豆多糖的工艺研究采用单因素法考察了狭山野豌豆多糖提取酶的种类及酶的最适使用量,通过正交试验确定了最适提取酶的最优提取时间、温度、p H值和提取次数。结果确定狭山野豌豆多糖的最优提取条件为,采用复合提取酶,最适的使用量为2.5%;提取次数:2次;提取温度:60℃;提取时间:1小时;提取p H值:4.0。最终验证结果,利用最优的提取条件提取狭山野豌豆多糖的提取率为11.6%。(2)狭山野豌豆多糖的分离采用水提醇沉的方法将狭山野豌豆多糖提取液进行不同浓度乙醇分级沉淀,冷冻干燥,得到4个多糖部位,分别为30%多糖、50%多糖、70%多糖和90%多糖。3、狭山野豌豆单体化合物和多糖的免疫活性研究考察狭山野豌豆单体化合物和多糖对巨噬细胞NO的释放量、迁移能力、吞噬中性红能力和小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。实验结果表明:(1)狭山野豌豆总多糖中分离得到的4个多糖部位能不同程度地激活巨噬细胞释放NO,通过与MTT实验相结合,确定了4个多糖部位的最适给药浓度:30%多糖和50%多糖部位为0.06μg/ml、0.23μg/ml、0.94μg/ml、3.75μg/ml;70%多糖和90%多糖部位最适给药浓度为0.94μg/ml、3.75μg/ml、15μg/ml、60μg/ml。(2)采用划痕法,测定巨噬细胞的迁移能力。结果表明,狭山野豌豆4个多糖部位对巨噬细胞的细胞迁移均无影响。(3)巨噬细胞吞噬中性红实验发现,考察的8个单体化合物中,除了绿原酸外,异槲皮苷、山柰酚、槲皮素、汉黄芩素、金丝桃苷、山柰苷和槲皮苷均能不同程度地增强巨噬细胞吞噬中性红的能力;狭山野豌豆的4个多糖部位也都能显著地增强巨噬细胞吞噬中性红的能力,对吞噬率的影响分别为30%多糖50%多糖70%多糖90%多糖。(4)在小鼠脾淋巴细胞增殖实验中,考察了6个单体化合物的免疫活性,化合物单独给药时,异槲皮苷、槲皮素、汉黄芩素、槲皮苷和山柰苷均能不同程度地增强小鼠脾淋巴细胞的增殖能力,而山柰酚则无影响。细胞经LPS处理后,槲皮素、汉黄芩素、槲皮苷均能在不同给药浓度下与单独LPS处理相比,显著地提高脾淋巴细胞增殖能力,其余单体均无影响;细胞经ConA处理后,异槲皮苷提高脾细胞的增殖能力最强,汉黄芩素、槲皮苷和山柰苷均能在不同给药浓度下与单独使用Con A处理相比增殖能力显著提高,但槲皮素增殖能力显著降低,由此推测槲皮素对Con A的增殖能力具有抑制作用,其余单体均无影响。(5)30%多糖和50%多糖能不同程度地提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力,且50%多糖提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力要优于30%多糖。而70%、90%多糖对脾淋巴细胞的增殖无影响。综上所述,本文对狭山野豌豆提取液乙酸乙酯层进行系统化学分离,得到18个化合物,鉴定17个化合物的结构,其中3个化合物为首次从狭山野豌豆中分离得到。并首次对狭山野豌豆的多糖提取工艺进行了考察,筛选出适合的提取酶和最优提取条件,首次对狭山野豌豆多糖不同分离部位与单体化合物的免疫活性进行研究,表明狭山野豌豆具有一定的免疫调节能力,为狭山野豌豆丰富资源的开发与利用提供了科学依据。
【学位单位】:辽宁大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2017
【中图分类】:R284;R285.5
【部分图文】:
总多糖溶液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓度至 30%,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 30%多糖。(2)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 50%多(3)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 70%多(4)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 90%多得到的 30%多糖、50%多糖、70%多糖和 90%多糖冻干,得置于干燥器中备用。分析糖标准曲线)中方法,得葡萄糖标准曲线,结果如图 2-1所示。
图 2-2 各因素水平效应曲面图由直观分析结果和方差分析结果可知:影响复合提取酶提取狭山野豌豆多糖的提取率的因素:温度(B)、pH 值(D)、提取次数(A)、时间(C)均为非显著影响因素。各因素各水平之间的趋势为:B3>B2>B1;D1>D2>D3;A2>A3>A1;C2>C1>C3,其中温度和 pH 值对狭山野豌豆多糖的提取率影响相对较大。通过直观分析表结合节约能源节省时间等因素,确定最优的提取工艺为A2B3C1D1,即最优提取工艺为提取温度为 60℃,提取时间为 1 小时,提取次数为 2次,提取 pH值为 4.0。2.4.4 正交试验验证实验结果按照 2.4.4的正交试验结果得到的最优提取工艺对狭山野豌豆的粉末进行提取,称取 5g 药材三份,置于 250mL 的锥形瓶中,加水 125mL,2.5%复合提取酶、调节 pH 值为 4.0,放于恒温水浴锅中在 60℃的温度下进行提取,提取时间1 小时,提取 2 次,合并提取液,浓缩,加水溶解,测多糖提取率如表 2-7 所示。
41图 3-1 MTT 法考察多糖不同部位对巨噬细胞存活率的影响MTT(噻唑蓝)法是一种检测细胞存活率的常用方法,原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan),而死细胞无此现象,再通过 DMSO 溶解甲瓒,检测 OD 值间接反映细胞的存活率。由图 3-1 所示,30%多糖部位在浓度为 1-6 时对巨噬细胞的存活率影响不大,特别是当多糖浓度在 3、4时,更能促进巨噬细胞的增殖,但当浓度为 7-8 时,细胞毒性显著增强,细胞数量不足空白的 50%,由此推断,30%多糖的给药浓度为 1-6 时,对细胞是安全的,即给药浓度为 0.004μg/ml-3.75μg/ml;50%多糖部位在浓度在 1-7 时,药物对细胞的存活率影响都不是很大,但当浓度达到 8 时,细胞的存活率明显下降,由此推断,50%多糖的给药
本文编号:2810667
【学位单位】:辽宁大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2017
【中图分类】:R284;R285.5
【部分图文】:
总多糖溶液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓度至 30%,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 30%多糖。(2)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 50%多(3)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 70%多(4)中得到的上清液中加入 95%乙醇,使体系中的乙醇终浓静置一夜,离心,上清液重复以上操作,合并沉淀得 90%多得到的 30%多糖、50%多糖、70%多糖和 90%多糖冻干,得置于干燥器中备用。分析糖标准曲线)中方法,得葡萄糖标准曲线,结果如图 2-1所示。
图 2-2 各因素水平效应曲面图由直观分析结果和方差分析结果可知:影响复合提取酶提取狭山野豌豆多糖的提取率的因素:温度(B)、pH 值(D)、提取次数(A)、时间(C)均为非显著影响因素。各因素各水平之间的趋势为:B3>B2>B1;D1>D2>D3;A2>A3>A1;C2>C1>C3,其中温度和 pH 值对狭山野豌豆多糖的提取率影响相对较大。通过直观分析表结合节约能源节省时间等因素,确定最优的提取工艺为A2B3C1D1,即最优提取工艺为提取温度为 60℃,提取时间为 1 小时,提取次数为 2次,提取 pH值为 4.0。2.4.4 正交试验验证实验结果按照 2.4.4的正交试验结果得到的最优提取工艺对狭山野豌豆的粉末进行提取,称取 5g 药材三份,置于 250mL 的锥形瓶中,加水 125mL,2.5%复合提取酶、调节 pH 值为 4.0,放于恒温水浴锅中在 60℃的温度下进行提取,提取时间1 小时,提取 2 次,合并提取液,浓缩,加水溶解,测多糖提取率如表 2-7 所示。
41图 3-1 MTT 法考察多糖不同部位对巨噬细胞存活率的影响MTT(噻唑蓝)法是一种检测细胞存活率的常用方法,原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan),而死细胞无此现象,再通过 DMSO 溶解甲瓒,检测 OD 值间接反映细胞的存活率。由图 3-1 所示,30%多糖部位在浓度为 1-6 时对巨噬细胞的存活率影响不大,特别是当多糖浓度在 3、4时,更能促进巨噬细胞的增殖,但当浓度为 7-8 时,细胞毒性显著增强,细胞数量不足空白的 50%,由此推断,30%多糖的给药浓度为 1-6 时,对细胞是安全的,即给药浓度为 0.004μg/ml-3.75μg/ml;50%多糖部位在浓度在 1-7 时,药物对细胞的存活率影响都不是很大,但当浓度达到 8 时,细胞的存活率明显下降,由此推断,50%多糖的给药
【参考文献】
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本文编号:2810667
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