和络泄浊方对TGF-β1诱导的HK-2细胞miR-200a、miR-29c表达的影响

发布时间：2020-09-03 15:19

　　 目的:通过培养HK-2细胞株,观察和络泄浊方对细胞miR-200a、miR-29c表达的影响,探讨和络泄浊方在治疗肾间质纤维化方面的应用。方法:1.选30只雄性SPF级3月龄大鼠用于和肾络大鼠含药血清的提取。30只大鼠随机分为两组:正常大鼠血清组和和肾络大鼠含药血清组。成人和肾络颗粒用量为30g/d,按“实验动物与人按体表面积等效量换算比率”可算出大鼠的等效剂量。大鼠为人体剂量的10倍,约为和肾络颗粒27g/d/kg。正常大鼠血清组大鼠每日给予等量的生理盐水灌胃。灌胃第7天下午给药后90min,各大鼠腹主动脉取血10ml。离心取上清液,56℃水浴30min灭活补体,0.22um,滤器过滤除菌,-80℃冰箱保存。2.HK-2细胞的培养和处理HK-2细胞在以5%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置37℃,5%CO2孵育箱内培养。实验时,将细胞按适当浓度接种于6孔板中,待细胞约70%-80%融合时,换成无血清DMEM/F12培养液培养24h,使细胞同步化。3.实验分组、EMT诱导和后续培养TGF-β1诱导HK-2细胞EMT形成间充质细胞。实验分为4组,分别为:正常细胞组、TGF-β1组(浓度为10ng/ml)、TGF-β1+5%正常大鼠血清组、TGF-β1+5%含药血清组,后续培养48h。4.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化将HK-2细胞以105/ml接种于预置无菌盖玻片的6空板中培养至70%-80%融合时,换成无血清DMEM/F12培养液培养24h,使细胞同步化。按照上述分组方案,加入相应药物,置37℃,5%CO2孵育箱内培养48h后,采用倒置相差显微镜观察EMT过程中各组细胞形态学变化,并拍照。5.Western Blot检测α-SMA、E-cadherin等的变化。6.miR-200a、miR-29c表达的检测根据Takara公司逆转录系统试剂盒说明合成第一条cDNA链,以cDNA为模板,U6小核RNA作为内参,进行SYBR Green定量PCR扩增。每份RNA样品均进行3次重复测验,采用2-△△Ct法计算相对表达量。7.分析miR-200a、miR-29c表达的改变,说明和络泄浊方对肾间质纤维化的影响机制。结果:经TGF-β1诱导36h后(B组),HK-2细胞内α-SMA的表达较对照组(A组)显著增加(P0.05),E-cadherin的表达显著减少(P0.01),miR-200a、miR-29c的表达较对照组(A组)均显著减少(P0.05);经5%普通大鼠血清后续培养48h后(C组),可见α-SMA、E-cadherin及miR-200a、miR-29c的表达改变无统计学意义(P0.05);而经5%大鼠含药血清后续培养48h后(D组),可见α-SMA表达较B组显著减少(P0.05),E-cadherin的表达显著增加(P0.05),miR-200a、miR-29c表达较B组均有显著升高(P0.05)。结论:和络泄浊方可以增加HK-2细胞中miR-200a和miR-29c的表达量,延缓肾间质纤维化过程。
【学位单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

结 果-2 细胞成功建立肾间质纤维化模型变常的 HK-2 细胞呈典型的铺路石样，细胞间联，细胞丧失铺路石样形态学特征，开始变长，变是仍然还有一部分为上皮细胞的形态（B）。herin 表达变化 TGF-β1 诱导 36h 后，可见细胞中 E-cadheri胞中显著下降(P<0.05)；α-SMA 的条带明显增升（P<0.05），提示造模成功。

GF-β1 诱导 36h 后，细胞丧失铺路石样形态学特征，开始变长，变为梭形，呈现成维细胞样外观，但是仍然还有一部分为上皮细胞的形态（B）。.1.2α-SMA、E-cadherin 表达变化如图 2 所示，经 TGF-β1 诱导 36h 后，可见细胞中 E-cadherin 的条带变细，其达量较正常 HK-2 细胞中显著下降(P<0.05)；α-SMA 的条带明显增粗，其表达量较常 HK-2 细胞显著上升（P<0.05），提示造模成功。图 1 TGF-β1 诱导前后 HK-2 细胞形态变化注：其中 A 为正常细胞，B 为经 TGF-β1 诱导 36h 后的细胞。

TGF-β1 诱导后，部分细胞丧失铺路石样形态学特征，开始变长，变为梭形，呈现成纤维细胞样外观，但是仍然还有一部分为上皮细胞的形态（B）；经过 5%普通大鼠血清后续培养的细胞与 TGF-β1 诱导后细胞相比形态无明显差异（C）；而经过 5%含药大鼠血清后续培养的细胞与 TGF-β1 诱导后细胞相比形态发生明显改变，细胞逐渐变短，逐渐恢复至正常形态（D）。

【参考文献】

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本文编号：2811616