灯盏花中野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化的干预作用及机制研究

发布时间：2020-09-07 15:35

　　目的:利用气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠模型观察野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化及其伴随的脂代谢紊乱的调节和改善肝脂变的作用,并以氧化应激为切入点深入探讨相关作用机制。材料与方法:SPF级雄性SD大鼠随机分成8组(n=8),空白对照组(Blank control)、模型组(H-S)、立普妥组(LIP5)、血府逐瘀汤组(XFZY20)、野黄芩苷高剂量组(SCU300)、野黄芩苷中剂量组(SCU100)、野黄芩苷低剂量组(SCU50)和NaHS组(NaHS)。动物分组后空白对照组给予普通饲料12周,其余各组采用喂饲成年大鼠特殊饲料12周,维生素D3腹腔注射600000 IU/Kg 3天(第一天至第三天),同时给予大鼠施加慢性、不可预见的应激性刺激(声、光、电)的方式,持续时间为12周;实验第9周各药物干预组开始分别灌胃给予立普妥5mg/kg/d、血府逐瘀汤20g(以含生药计)/kg/d、野黄芩苷300 mg/kg/d、100 mg/kg/d、50 mg/kg/d,腹腔注射NaHS 2.8mg/kg/d,每日1次,每周测量大鼠体重并观察大鼠的精神状态、被毛和舌象,并给予评分。药物连续干预4周后,禁食16h麻醉大鼠,腹主动脉采血,分离血清或血浆,应用全自动生化仪检测ALT、AST、BUN、CREA、ALB、TP、LDL-C、HDL-C、CHOL、TG等生化指标,应用Sysmex CA-1500型全自动血凝分析仪检测FIB、PT、APTT、TT,应用血液粘度仪检测全血粘度(高、中、低切粘度)和血浆粘度,应用亚甲基分光光度法检测血清中H_2S浓度;应用英国moor激光多普勒血流仪,检测大鼠尾部正中、心脏、肝脏、右肾脏组织血流量指标;分离肝脏、主动脉、心脏、肾脏等组织,滤纸吸干水分。肝脏、肾脏及心脏称重,计算脏体指数,切取一部分组织于-80℃冰箱保存,用于后面的实验;其余放福尔马林中固定,待组织病理学分析备用。利用HE染色观察大鼠肝脏脂肪变性和胸主动脉硬化病变情况以及各药物干预情况;应用TBA法检测血清和肝组织MDA浓度,应用羟胺法检测血清和肝组织T-SOD活力,应用分光光度法检测血清和肝组织GSH含量;利用Western blot、免疫荧光及qPCR技术检测野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠肝组织和胸主动脉中抗氧化应激重要调控因子Nrf2及其下游NQO1、HO-1基因和蛋白表达的影响;进一步利用Western blot和免疫荧光技术检测野黄芩苷对Nrf2因子上游PI3K/Akt信号通路中的PI3K P85和磷酸化Akt(Ser473)活性蛋白在肝组织和主动脉中表达的影响;利用qPCR技术分别检测肝组织和主动脉中Akt基因的表达水平;利用Western blot及qPCR技术检测野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠肝组织和胸主动脉中内源性气体分子H_2S的重要生成及调节基因CSE表达的影响。结果:1.野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠脂代谢的调节及肝脂肪变性的保护作用。经野黄芩苷干预4周,气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠体重止降,且逐渐恢复;实验结束时,其可显著降低肝重及肝体指数、肾体指数、心体指数(PO.O1),并对肝功能有一定的保护作用;野黄芩苷可显著降低气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠血清中LDL-C、HDL-C、CHOL和AI指数(PO.O1),调节体内脂代谢,改善血脂水平;此外,野黄芩苷可显著降低血清CREA,提示其在一定程度上可以保护肾功能。肝脏大体观察表明,空白对照组大鼠肝脏形态大小正常,色泽红润,表面光滑,边缘锐利;模型组大鼠肝脏呈黄褐色,边缘钝而厚,表面粗糙,油腻感,部分肝脏表面可见黄色小结节,提示大鼠肝脏脂肪变性严重;给予野黄芩苷后大鼠肝脏较模型组有所改善,颜色偏红褐色,表面光滑。组织病理学检查表明,模型组可见弥漫性肝细胞脂肪变性,肝小叶结构破坏甚至炎细胞浸润,肝细胞肿胀,呈气球样变,胞质内可见大量脂肪空泡,核被挤于细胞边缘;经野黄芩苷干预4周后,肝组织结构较正常,偶尔可见肝索排列,肝细胞气球样变程度减轻,胞质内大泡性脂滴明显减少,炎性细胞浸润程度明显改善,可见散在肝细胞脂肪变性,以小空泡脂肪变为主。结果表明,野黄芩苷可以减轻气滞血瘀型AS大鼠的肝脂肪变和脂代谢紊乱。2.野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠血瘀状态的调节及胸主动脉硬化的影响。经野黄芩苷干预4周,气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠精神状态、被毛、舌象等明显改善(PO.O5),血流变学指标全血粘度中、高切及血浆粘度呈显著降低(PO.O5),凝血因子APTT明显延长(PO.O5),大鼠尾、心、肝、肾组织血流量得到明显改善(PO.O1),结果表明,野黄芩苷可以改善气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠的气滞血瘀状态,其作用效果与活血化瘀典方药物血府逐瘀汤相当。组织病理学检查大鼠胸主动脉病变情况,空白对照组动脉壁各层结构正常,未见明显病变(0级)。气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠可见动脉内皮下脂质沉积,斑块内见坏死组织及钙化,动脉中层平滑肌细胞可见明显钙化(Ⅳ级、Ⅴ级、Ⅶ级)。经野黄芩苷干预4周病变程度后较模型组明显改善,低剂量组大鼠动脉管壁增厚,平滑肌细胞增生,内皮下局灶性脂质沉积、纤维组织增生,形成斑块,中层平滑肌细胞增生、可见钙化(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ级);中剂量组大鼠动脉管壁增厚,中层平滑肌细胞增生及零星钙化,内皮下局灶性脂质沉积、纤维组织增生,形成斑块较低剂量组略小(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ级);高剂量组动脉管壁增厚,中层平滑肌细胞增生,内皮表面不光滑,但未见脂质沉积(Ⅴ级)。由此可见,野黄芩苷可以减轻气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠胸主动脉的硬化程度,抑制斑块的形成。3.野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠的抗氧化应激作用及其可能的机制研究。野黄芩苷干预4周后,气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠血清GSH含量显著上升(PO.O5),血清SOD活力也有升高趋势;进一步检测肝组织中各氧化应激相关指标的变化情况,发现野黄芩苷各剂量组MDA水平明显降低(PO.O1),SOD活力及GSH含量显著升高(PO.O1),结果提示,野黄芩苷可以调节气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠的MDA、SOD、GSH水平,从而发挥其抗氧化应激的作用。Western blot和免疫荧光检测结果显示,肝组织中的p-Nrf2蛋白表达水平在野黄芩苷干预4周后呈现明显上升(PO.O1),并其下游抗氧化酶NQO1和HO-1也伴随着呈显著高表达(PO.O1),这一结果在应用Western blot检测胸主动脉p-Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达中也得到了确证;在基因水平检测中,肝和胸主动脉Nrf2 mRNA及其下游NQO1mRNA的表达趋势与蛋白表达基本相同;进一步提示,野黄芩苷发挥抗氧化应激的机制可能是激活Nrf2/ARE信号通路,上调其下游NQO1和HO-1,释放SOD、GSH等抗氧化物质。进一步研究Nrf2因子的上游调控信号通路PI3K/Akt,发现野黄芩苷可以显著增加肝组织和胸主动脉中PI3K P85和磷酸化Akt(Ser473)蛋白表达水平(PO.O1),免疫荧光检查进一步显示PI3K P85在肝组织中呈高表达(PO.O1);在基因水平检测中,野黄芩苷可以明显上调在肝组织和胸主动脉中AKT mRNA基因表达,这与蛋白表达结果基本一致;同时,p-AKT活化蛋白与p-Nrf2表达具有相关性,前者可以促进后者核转位,调节其转录活性,促进与ARE的结合。上述结果提示,野黄芩苷也可能激活PI3K/Akt信号通路,通过激活的p-Akt来活化Nrf2,实现其抗氧化应激,保护细胞作用。4.野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化大鼠内源性气体分子信号通路H_2S/CSE的影响。气滞血瘀型AS大鼠血清中H_2S浓度呈明显升高,野黄芩苷干预4周后,其血清中H_2S浓度显著下降(PO.O1);同时,野黄芩苷可以下调体内H_2S重要生成及调节因子CSE的蛋白表达水平,但其肝中基因水平呈明显高表达(PO.O1),主动脉CSE mRNA却未见明显的影响。该结果提示,野黄芩苷可能与内源性气体分子H_2S有关,其可以作用于肝组织内源性气体分子H_2S/CSE信号通路,在一定程度上调节H_2S的释放,但具体机制还需要进一步研究证实。结论:1、野黄芩苷可以通过活血化瘀、降血脂及抗氧化应激,三方面综合作用实现抗气滞血瘀型动脉粥样硬化的药理作用。同时,本实验中未见野黄芩苷对肝肾损伤的影响,这一点优于临床常用降脂药立普妥。2、本研究重点以氧化应激为着眼点,探讨野黄芩苷抗气滞血瘀型AS可能的作用机制:(1)直接激活Nrf2/ARE信号通路,启动ARE调控基因的转录,激活NQO1、HO-1蛋白表达,增强SOD活力、提高GSH含量,减少MDA水平等,实现抗氧化应激作用。(2)通过调控PI3K/Akt信号通路,上调PI3K,Akt磷酸化并激活,从而活化下游Nrf2因子,激活体内调节氧化应激重要通路Nrf2/ARE信号通路。3、气滞血瘀型AS与内源性气体信号分子H_2S间存在联系,其内在机理还需深入研究;野黄芩苷作用于肝组织内源性气体分子H_2S/CSE信号通路,调控其对血管的调节作用。
【学位单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

精神状态,野黄芩苷,大鼠,情况

各组大鼠实验期间每周观察精神状态评分情况（x±SE）

精神状态,被毛,情况

各组大鼠实验期间每周观察被毛评分情况（x±SE）

舌象,野黄芩苷,情况

图 1.3 各组大鼠实验期间每周观察舌象评分情况（ x±SE）2.野黄芩苷对大鼠体重、脏器重量及脏器指数的影响如图 2.1 大鼠体重动态图所示，在整个实验周期中空白对照组大鼠呈现稳步上升；而经特殊饲料喂养和应激性刺激联合诱导的 SD 大鼠体重波动范围较小，出现先小幅下降，第 3 周降为谷底，而后第 4 周小幅上升，并一直维持到第 9 周。第 9 周开始药物干预后，各组体重变化表现不一，第 12 周（给药后 4 周）模型组大鼠体重呈继续下降趋势，野黄芩苷高中剂量组大鼠体重基本持平，并与模型组比较呈显著差异（P<0.01）；野黄芩苷低剂量组大鼠体重仍呈下降趋势，并与模型组比较无显著差异（P>0.05）；立普妥组与血府逐瘀汤组大鼠体重也呈基本持平，并与模型组比较呈显著差异（P<0.01）。具体数据见附表 4。

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