基于JAK-STAT信号通路研究黄芪桂枝五物汤对类风湿关节炎的作用机制

发布时间：2020-09-10 11:46

　　目的以牛Ⅱ型胶原加弗氏完全佐剂建立胶原诱导型类风湿关节炎(CIA)大鼠模型,观察黄芪桂枝五物汤(HGW)对模型大鼠的关节炎指数、关节病理、足趾肿胀度、血流变、滑膜细胞凋亡、相关细胞因子和JAK3/STAT3信号通路等的影响,以探讨黄芪桂枝五物汤(HGW)对胶原诱导型类风湿关节炎大鼠的治疗作用及其机制。方法SPF级SD雄性大鼠72只,适应性喂养1周后,随机分为2组:N组(12只)和CIA组(60只)。将牛Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂1:1充分乳化,即胶原浓度为1 g·L~(-1)。于CIA组每只大鼠右后足爪、背部、尾根三点各皮下注射乳化剂0.1 mL,7 d后以0.1ml乳化剂加强免疫一次,以免疫加强当天为d 1。致炎后d 15,将CIA组随机分为五组:CIA组、黄芪桂枝五物汤低剂量(HGW-L)组、黄芪桂枝五物汤中剂量(HGW-M)组、黄芪桂枝五物汤高剂量(HGW-H)组及Tofacitinib(TFN)组。将黄芪桂枝五物汤常规煎煮并浓缩药物,按10 mL·kg~(-1)体质量ig给药。HGW-L、HGW-M、HGW-H组药物剂量分别为16、32、64 g·m L~(-1),相当于临床常人用量的3、6、12倍,TFN药物剂量为15 mg·kg~(-1),N、CIA组每日给予10 mL·kg~(-1)的蒸馏水,疗程均为4周。胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型建立完成后,每周采用水容积法测量大鼠下肢容积;对大鼠关节炎指数进行评分;经HGW治疗4周后光镜下观察各组大鼠踝关节病理形态;TUNEL染色检测大鼠滑膜细胞的凋亡。采用全自动血流变仪检测大鼠外周血中全血高切及低切粘度;ELISA法检测大鼠外周血中CollagenII Ab抗体、IL-1β、IL-3、GM-CSF、IL-8、IL-11、IFN-r、RF、CRP等细胞因子的含量;流式细胞术检测外周血中IL-2、IL-4、IL-10、IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的含量;免疫组化法检测大鼠滑膜组织中VEGF、Bcl-2、BAX、SOCS1、SOCS3、STAT1、STAT3、JAK3的蛋白表达水平;采用Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察STAT3、JAK3及其负反馈调节因子SOCS1、SOCS3的蛋白表达水平。结果N组大鼠毛色白亮、光泽度好,进食可,四肢活动自由,反应灵敏,足爪未见肿胀,体重增长快且平稳;CIA组大鼠毛发暗淡无光泽,进食明显减少,双后足肿胀溃烂伴跛行,时有哀鸣、喜扎堆,弓背蜷缩,摄食量降低,大便质稀,反应迟钝,体重增加不明显;各用药组大鼠毛色光泽度及进食较前改善,双后足肿胀度及跛行减轻,活动量增加,体重增长平稳。造模完成后,大鼠双足足跖及踝关节出现红肿热等急性免疫反应;第2周,与N组比较,CIA组大鼠足趾肿胀度极显著升高(P0.01);第2周和第6周,与N组相比,CIA组大鼠关节炎症积分极显著差异(P0.01)。第2周,与CIA组相比,TFN组和HGW-L、M、H组大鼠关节炎症积分未见明显差异,无统计学意义(P0.05);第6周,与CIA组相比,TFN组和HGW-M、H组大鼠关节炎症积分差异显著(P0.05,P0.01)。与N组相比,CIA组大鼠血清RF、CRP、CollagenII抗体含量有极显著差异(P0.01)。在光学显微镜下观察发现:N组大鼠滑膜细胞排列规则无增生,血管散在分布,关节腔内未见渗出物,关节表面光滑。CIA组大鼠滑膜细胞大量增生、血管翳形成,可见大量炎性细胞浸润,关节面粗糙,关节软骨破坏严重。TFN组和HGW-L、M、H用药组干预后不同程度抑制了滑膜组织的增生,单核及淋巴细胞有不同程度的减少。与N组比较,CIA组大鼠STAT3、SOCS1蛋白表达水平显著升高(P0.05,P0.01);与CIA组比较,HGW-H组大鼠STAT3、JAK3、SOCS1蛋白表达水平显著降低(P0.05);与CIA组比较,TFN组大鼠JAK3蛋白表达水平显著降低(P0.05)。与N组相比较,CIA组大鼠滑膜细胞增多,凋亡率显著下降(P0.05);与CIA组比较,HGW-H组大鼠Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.05)。与N组比较,CIA组大鼠在30/s、1/s切变率下的全血粘度和200/s切变率下的血浆粘度、红细胞聚集指数均显著升高(P0.01);与CIA组比较,HGW-H组、TFN组大鼠IL-4、IL-10的含量显著升高(P0.05,P0.01);与N组比较,CIA组大鼠IL-1β的含量显著升高(P0.05),IL-3、GM-CSF含量显著降低(P0.05)。结论(1)黄芪桂枝五物汤对CIA模型大鼠足趾的关节炎症有明显的治疗作用,其机制可能是HGW通过调节了CIA大鼠外周血中炎细胞因子IL-2、IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-r、RF、CRP、CollagenII的分泌,对减少软骨细胞的损伤和凋亡,减轻软骨和滑膜的损伤,保护关节起到抗炎,调节免疫的作用。(2)黄芪桂枝五物汤能够促进滑膜细胞的凋亡,可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。(3)黄芪桂枝五物汤通过对JAK3/STAT3信号通路蛋白的抑制作用而起到抗炎和免疫调节。
【学位单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

肿胀度,踝关节,模型大鼠,大鼠

表 4 HGW 对 CIA 模型大鼠右侧踝关节肿胀度的影响（x±s，n=12）分组第 1 周第 2 周第 3 周第 4 周第 5 周第 6 周N 10.79±3.12 11.85±2.87 19.50±3.80 24.57±4.95 29.38±6.82 30.28±6CIA 62.88±6.21*64.96±7.28*87.43±6.44*87.50±5.65*87.22±8.72*87.43±8HGW-L 61.11±8.05 66.21±7.04 85.22±6.91 81.03±6.12 79.20±7.15 71.97±6HGW-M 59.49±6.21 62.51±8.09 83.70±5.28 77.28±6.85▲69.12±5.16▲62.13±6HGW-H 58.31±4.32 63.26±6.12 79.32±5.55▲72.98±8.67▲63.48±5.92▲54.38±8TFN 58.78±2.39 63.80±6.82 73.42±5.78▲72.95±6.59▲64.98±8.15▲58.32±4注：与 N 组相比，*P㩳0.05；与 CIA 组相比，▲P㩳0.05；

模型大鼠,差异显著,剂量,大鼠

TFN 组和 HGW-M、H 组大鼠关节炎症积分差异显著（P＜0.05，P＜0 5，图 3）。表 5 HGW 对模型大鼠关节炎指数的影响（x ±s，n=12）组别剂量/ g·m L-1第 2 周第 6 周N - 0.00±0.00 0.00±0.00CIA - 9.85±0.96**10.35±0.95**TFN 15 ×10-39.71±1.32 6.74±0.76▲▲HGW-L 16 9.56±0.83 9.02±0.84HGW-M 32 9.84±1.35 8.95±0.83▲HGW-H 64 9.68±0.91 7.83±0.71▲▲注：与 N 组相比，**P㩳0.01；与 CIA 组相比，▲P㩳0.05，▲▲P㩳0.01；

模型大鼠,大鼠,免疫组化检测

5 黄芪桂枝五物汤对 JAK3/STAT3 信号通路蛋白的影响免疫组化检测大鼠关节滑膜 JAK3、STAT3、SOCS1 的结果：与 N 组比较组大鼠 STAT3、JAK3、SOCS1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）IA 组比较，HGW-H 组大鼠 STAT3、JAK3、SOCS1 蛋白表达水平显著降低5）；与 CIA 组比较，TFN 组大鼠 JAK3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）（ 5、8、9、10）。免疫组化检测大鼠关节滑膜 STAT1、VEGF、SOCS3 的结果：与 N 组比较组大鼠 STAT1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与 N 组比较，D E FA:N 组 B:CIA 组 C:HGW-L 组 D:HGW-M 组 E:HGW-H 组 F:TFN 组图 4 HGW 对模型大鼠关节滑膜病理的影响（HE,×200）

【参考文献】