正交设计联用改良式明胶法优化虎杖提取与除鞣工艺及其体外抑菌活性的研究

发布时间：2020-09-10 11:58

　　背景及目的:目前,由于临床上抗感染疾病的治疗对于抗生素类药物的过度依赖甚至滥用,导致了细菌耐药菌株的不断出现,甚至出现了对多种抗生素耐药的“超级细菌”。使得临床上感染性疾病的治疗非常棘手,细菌耐药性问题亟待解决。探究出新思路和新途径来寻找新的抗菌药物,从而以其控制和降低细菌的耐药性显得十分的迫切。在抗生素尚未问世之前,我国预防和治疗细菌感染性疾病,多予以具有清热解毒功效的中草药进行治疗。因此,在清热解毒类中草药中筛选有效的天然抑菌药物,为对抗和控制细菌耐药性问题开辟一种新的可行性途径,引起了国内外学者的日益关注。虎杖药用历史悠久,为具有清热解毒功效的传统中药。现代药理学研究进展表明其具有抗菌、抗炎、抗病毒。在前期筛选具有抑菌作用中草药时发现虎杖的水煎液在体外具有较强抑菌活性。其中,虎杖中的大黄素、虎杖苷为是其发挥抑菌药效的主要活性成分。本研究主要目的是利用正交设计并联用改良式明胶法优化虎杖中的抑菌活性成分大黄素、虎杖苷的提取与除鞣工艺;优化RP-HPLC法测定虎杖苷、大黄素含量的色谱条件;在优化的最佳工艺条件下再进一步对虎杖提取液进行体外抑菌药效学的研究。方法:1.采用水提醇沉法对虎杖中抑菌活性成分大黄素、虎杖苷进行提取。正交设计法优化虎杖提取工艺,选择L_9(3~4)正交表安排试验,对影响虎杖有效成分提取的取次数、时间、料液比及药用醇浓度四因素进行综合考察。2.采用改良式明胶法去除虎杖药液中的鞣质成分,设无明胶组与1%、2%、3%明胶除鞣组,分析除鞣前后大黄素、虎杖苷含量与药液澄明度变化。3.RP-HPLC法对虎杖提取的指标成分大黄素、虎杖苷进行含量测定分析。4.将优化的最佳工艺条件下提取的虎杖药液对试验菌大肠杆菌(G~-)、铜绿假单胞菌(G~-)、金黄色葡萄球菌(G~+)及真菌白色念珠菌进行体外抑菌活性研究。以市售洁尔阴洗液(国药准字Z10930008)作为抑菌实验的阳性对照药。二倍稀释法测定虎杖药液对四种致病菌最小抑菌浓度(MIC);绘制虎杖药液对四种菌生长抑制量效曲线;采用UV法与电导率法测定经虎杖药液作用后金葡菌的培养液在波长260nm与280nm吸光度与电导率的变化;药敏纸片法(K-B法)测定虎杖药液对四种菌的抑菌圈(IDZ)大小;菌药共孵育-平皿法测定虎杖抑菌作用起效所需共孵育的时间。结果:1.正交设计联用改良式明胶法优化虎杖中大黄素、虎杖苷的提取的最佳工艺组合为:A_2B_3C_3D_3,即料液比为1:10(g/ml)、提取3次、提取时间为90min、80%药用醇进行醇沉;虎杖的最佳除鞣工艺条件为:2%明胶浓度的改良式明胶法。2.稀释法测定虎杖抑菌的MIC结果:对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的MIC值分别为12.5、25、25、6.25mg/ml;3.在2、1、1/2、1/4、1/8MIC五种不同虎杖药液浓度下,四种菌的生长受到不同程度的抑制作用,其中2MIC的虎杖药液浓度明显抑制了四种菌的生长,使其不能进入对数生长期,生长曲线平缓,呈非典型生长;在1、1/2、1/4、1/8MIC虎杖药液浓度的作用下四种菌的生长受到一定程度的抑制作用,虽仍可以进入对数生长期,但由于抑菌作用延缓和降低了其进入对数生长期的进程;加入虎杖药液的金葡菌培养液,随抑菌作用时间延长测得培养液电导率值、OD_(260)与OD_(280)值不断增大,均高于未加药的对照组;4.K-B法测定虎杖药液对E.coli、P.aer、S.aur、C.alb的IDZ值分别为18±0.2、14±0.2、17±0.2、19±0.2mm;洁尔阴洗液的IDZ值分别为18±0.2、11±0.2、17±0.2、18±0.2mm;5.菌药共孵育结果:虎杖药液对E.coli、P.aer、S.aur、C.alb分别在共孵育12、12、8、8h为明显抑菌起效时间;洁尔阴洗液明显抑菌起效的菌药共孵育时间分别为12、12、8、12h。结论:1.正交设计联用改良式明胶法优选出的最佳提取与除鞣工艺条件稳定可靠、操作简单、虎杖药液澄明度、稳定性好,虎杖中抑菌活性成分大黄素、虎杖苷提取率高。2.虎杖体外抑菌活性研究的四项抑菌活性指标显示虎杖水煎液在对四种常见致病菌均具有明显的抑菌作用;其体外抑菌活性与市售的国药准字号洁尔阴洗液相比活性相当或更优。3.虎杖抑菌作用机制初步研究结果表明,虎杖对金葡菌的抑菌作用可能是通过破坏其细胞膜结构或功能,导致细胞膜的通透性发生改变,使得菌体细胞中的无机盐离子、核酸与蛋白质等大分子发生外渗,导致菌体的正常形态和代谢过程受到破坏和影响,从而起到抑菌或杀菌作用。4.研究采用的药敏试验方法菌药共孵育-平皿法可在近似模拟在人体内较适宜pH值液体环境下,药液与细菌共孵育过程中直接接触发生抑菌相互作用,可得出药液对不同试验菌出现明显抑菌作用共孵育所需的时间。具有结果直观、准确、快速、可靠的优点,实验结果表明其可作为研究液体类抗菌药物体外抑菌作用的一种适用的方法。虎杖体外抑菌活性结果显示其是一味极具有研究和开发价值的抗菌作用中药。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284;R285

【参考文献】