基于FXR、代谢酶和转运体探讨茵栀黄口服液对环孢素A诱导的胆汁淤积性肝损伤的保护作用及机制

发布时间：2020-09-10 15:28

　　背景和目的:环孢素A(CsA)是一种免疫抑制剂,常用于器官和组织移植后的抗免疫排斥反应,但由于其诱导的高胆红素血症、高胆固醇血症以及胆汁淤积性肝损伤等不良反应,使用往往受到限制。临床研究表明,中药复方茵栀黄(YZH)可增强胆红素和胆汁酸的清除,广泛用于新生儿黄疸或胆汁淤积症。本研究的目的是确定茵栀黄对环孢素A诱导的胆汁淤积性肝损伤的保护作用及其分子机制。方法:1.动物造模:雄性SD大鼠32只,将大鼠按体重随机分为正常组、环孢素A组、茵栀黄组和熊去氧胆酸组,每组8只。正常组:口服灌胃给予大鼠0.5%CMC-Na混悬液;环孢素A组:口服灌胃给予环孢素A(CsA,30 mg·kg~(-1))混悬液,每日两次,连续10天进行给药处理;茵栀黄处理组:口服灌胃给予茵栀黄口服液(YZH,5 mL·kg~(-1)),每日两次,同时口服灌胃给予环孢素A混悬液,连续10天进行给药处理;熊去氧胆酸组:口服灌胃给予熊去氧胆酸(UDCA,25 mg·kg~(-1))混悬液,每日两次,同时口服灌胃给予环孢素A混悬液,连续10天进行给药处理。2.检测药效学指标:(1)检测大鼠血清生化指标TBIL、DBIL、IBIL、TBA、ALT和AST的水平,评估大鼠肝功能的变化;(2)采用苏木精伊红染色(HE染色)观察各组大鼠肝组织的病理学改变;(3)检测肝脏中氧化指标如超氧化物歧化酶(SOD),还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平变化。3.建立LC-MS/MS同时测定大鼠血清中15种胆汁酸的含量的分析方法,并且对Control组、CsA组、YZH组和UDCA组大鼠血清中胆汁酸的含量进行测定和分析。4.采用RT-PCR和Western blot方法检测大鼠肝脏中Fxr、Mrp2、Bsep、Ntcp、Oatp2、Ugt1a1和Cyp7a1的基因和蛋白表达水平。免疫组织化学(IHC)用于测定大鼠肝组织中Bsep和Mrp2的表达水平。5.建立茵栀黄及其有效成分京尼平苷酸(GPA)、黄芩苷(BA)和绿原酸(CHA)干预环孢素A诱导的LO2细胞模型,采用RT-PCR和Western blot法检测LO2细胞中FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、CYP7A1和UGT1A1基因和蛋白表达水平,探究茵栀黄及其有效成分对这些代谢酶和转运体的影响。结果:茵栀黄(YZH)能够显著降低环孢素A(CsA)诱导的胆汁淤积大鼠的血清生化指标ALT、AST、TBIL、DBIL和TBA水平,并且显著增加大鼠肝脏SOD活力和GSH水平。此外,HE实验表明,YZH能够显著减轻肝细胞坏死和退行性变化,胆管增生以及炎性细胞浸润,这表明YZH能够保护CsA诱导的胆汁淤积性肝损伤。本实验成功建立了LC-MS/MS同时测定大鼠血清中15种胆汁酸成分的分析方法,并且对Control组、CsA组、YZH组和UDCA组大鼠血清中胆汁酸的含量进行测定和分析。结果发现CsA能够显著增加大鼠血清中胆汁酸成分如CA、GCDCA、TCDCA和TCA的含量,同时显著降低血清中UDCA的含量。与CsA组相比,YZH能够显著增加大鼠血清中UDCA的含量,并且降低CA、GCDCA、TCA和GCA的含量。蛋白和基因分析显示CsA能够显著降低大鼠肝脏中核受体Fxr的表达,并且降低Mrp2、Bsep、Ntcp和Oatp2转运系统的蛋白表达,同时CsA也能够显著增加胆汁酸合成酶Cyp7a1的蛋白表达并降低胆红素代谢酶Ugt1a1的蛋白表达。相比之下,YZH显著增加Fxr的蛋白表达,同时显著增加外排转运体Mrp2和Bsep的蛋白表达,抑制Cyp7a1的蛋白表达并且增加Ugt1a1的蛋白表达。此外,体外实验证明CsA处理的LO2细胞中FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、UGT1A1和CYP7A1蛋白表达水平的变化与大鼠肝脏中的蛋白变化趋势一致。YZH显著增加FXR、MRP2、BSEP和OATP2的表达,并且降低CYP7A1酶和增加UGT1A1酶的表达。另外,LO2细胞实验发现京尼平苷酸,黄芩苷和绿原酸是YZH的活性药物成分,能够不同程度地促进或抑制FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、UGT1A1和CYP7A1的表达。结论:茵栀黄对环孢素A诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠具有保肝作用,对胆汁淤积及其引起的肝损伤有显著的保护作用。其机制可能是YZH通过调节核受体FXR,及其下游相关转运体MRP2、BSEP、NTCP和OATP2以及代谢酶CYP7A1和UGT1A1的表达,改善胆汁酸和胆红素的体内蓄积,从而预防和治疗CsA诱导的胆汁淤积性肝损伤。此外,京尼平苷酸,黄芩苷和绿原酸是茵栀黄发挥药理作用的有效成分,能够通过调节胆汁酸和胆红素代谢酶和转运体发挥保肝作用。总而言之,茵栀黄作为传统中药复方,可能成为预防和治疗CsA诱导的胆汁淤积性肝损伤的潜在药物。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

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图 1-1 茵栀黄对环孢素 A 诱导的大鼠血清生化指标的影响注：空白组（Control），环孢素 A组（CsA），茵栀黄组（YZH+CsA），熊去氧胆酸组（UDCA+CsA）；与空白组相比*P<0.05，**P<0.01，**P<0.01；与环孢素 A 组相比#P<0.05，##P<0.01。4.2 H&E 染色观察茵栀黄对环孢素 A 诱导的肝损伤的保护作用正常组大鼠肝脏组织 H&E 染色观察显示中央静脉、汇管区结构正常，肝小叶结构完整，细胞未见水肿变性（图 1-2 A）；与正常组肝脏形态相比，CsA 处理的大鼠中清楚地观察到肝细胞水肿，脂肪变性，肝细胞坏死，炎性细胞浸润和胆汁淤积（图 1-2 B）；而 YZH 或 UDCA 处理的大鼠肝细胞坏死和炎性细胞浸润得到明显改善，减轻胆管增生和胆汁淤积（图 1-2 C，D）。

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熊去氧胆酸（UDCA）处理组大鼠肝脏中 MDA 含量较环孢素 A 处理组显著降低（P<0.01），如下图1-3 所示。图 1-3 茵栀黄对环孢素 A 诱导的大鼠肝脏中 SOD、GSH 和 MDA 的影响注：空白组（Control），环孢素 A组（CsA），茵栀黄组（YZH+CsA），熊去氧胆酸组（UDCA+CsA）；与空白组相比*P<0.05，**P<0.01；与环孢素 A 组相比#P<0.05。5.讨论CsA 是一种有效且强大的免疫抑制剂，能够抑制 T 细胞受体信号转导途径，在临床治疗过程中可能会导致高胆红素血症、高胆汁酸血症以及胆汁淤积性肝损伤，因此其使用往往受到限制[3-5]。尽管进行了广泛的研究，但 CsA 诱导的肝毒性的具体机制仍不清楚。茵栀黄具有利湿和退黄之效

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