基于液相—高分辨质谱的多基原钩藤生物碱系统表征研究

发布时间：2020-09-11 13:40

　　 钩藤(Uncariae Ramulus Cum Unicis)是一种常用的息风止痉类中药,其主要活性成分为生物碱,临床上用于治疗心血管及中枢神经系统疾病。2015版《中国药典》将五种茜草科植物,包括钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil、大叶钩藤U.macrophylla Wall.、毛钩藤U.hirsuta Havil.、华钩藤U.sinensis(Oliv.)Havil.和无柄果钩藤U.sessilifructus Roxb.的干燥带钩茎枝一同列为中药钩藤的基原植物,但这五种钩藤中生物碱成分的差异尚不明确,缺乏系统的化学表征和比较;氧化吲哚生物碱作为质控的重要指标成分,其制备分离困难;市售钩藤的植物基原不明确,缺乏有效的判别手段,因此阻碍了对中药钩藤质量的有效控制。针对以上问题,本论文基于液相-高分辨质谱(LC-HRMS)分析平台,提出“活性生物碱成分群”系统研究策略,建立灵敏、高效的靶向表征方法,对五种钩藤的生物碱进行系统的表征和比较,以阐明多基原钩藤的化学物质基础,为其质量控制提供科学依据。1.五种钩藤的生物碱成分研究构建钩藤属样品库,收集并鉴定五种钩藤共150批;构建基于UNIFI软件的钩藤属生物碱数据库,收录生物碱结构143个;采用UHPLC/LTQ-Orbitrap质谱,在正离子模式下对五种钩藤进行化学轮廓分析,通过自建数据库检索和多级质谱信息比对等锁定目标生物碱;开展LC-MS导向的大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤和钩藤的化学成分研究,分离鉴定了38个生物碱,其中9个为新化合物。2.不稳定对照品的制备方法研究以大叶钩藤中四个氧化吲哚生物碱的分离为例,开发不稳定生物碱对照品的分析制备方法。采用以CO_2作为流动相的超临界流体色谱(SFC)技术,选择能使化合物稳定存在的乙腈作为流动相改性剂,进一步优化固定相、流动相添加剂、柱温、背压和流速等,分别采用Torus 1-AA和Torus Diol柱,建立了两个超高效SFC分析方法;并采用制备SFC和Viridis Prep Silica 2-EP OBD制备柱得到纯度大于95%的四个化合物。3.五种钩藤中生物碱的系统表征和比较通过系统研究对照品裂解规律及二维液相分离和质谱靶向表征方法,本论文提出多种新颖的LC-MS分析策略,并对五种钩藤的生物碱进行了系统表征和比较。(1)采用UHPLC/LTQ-Orbitrap质谱,在正离子模式下研究了48个生物碱的MS~n裂解行为,总结了不同亚型生物碱的裂解规律。通过比较CID(collision-induced dissociation)和HCD(high-energy C-trap dissociation)模式下生物碱裂解行为的差异,建立了MS~2/CID-MS~3/HCD碎片获取方法。(2)采用UHPLC/LTQ-Orbitrap质谱对生物碱靶向表征方法进行深入的研究,并建立了三个基于质量亏损过滤(MDF)的靶向表征方法。方法一:结合传统的矩形MDF和中性丢失过滤(162.05 Da)方法,分别过滤游离生物碱和生物碱糖苷成分,最终从钩藤(U.rhynchophylla)中鉴定了60个游离生物碱和32个生物碱糖苷;方法二:构建多边MDF算法,靶向过滤潜在的生物碱,同时结合母离子列表(PIL)高选择性地触发多级质谱裂解,最终从华钩藤茎、叶、花三个部位中共鉴定了198个生物碱;方法三:基于PIL的在线栅状MDF方法,结合理论的步进式母离子列表(step-wise PIL)和最优的母离子质量宽度(±55 mDa),在数据采集的同时实现栅状MDF过滤,靶向灵敏地触发目标生物碱的质谱裂解。(3)基于不同pH条件下带正电荷反相和传统反相的正交分离机制,分别采用酸性条件下的XCharge C18柱和碱性条件下的Kinetex EVO C18柱作为第一维和第二维色谱柱,构建了离线全二维液相分离系统。结合二维液相系统和基于step-wise PIL的栅状MDF扫描方法,对五种钩藤的生物碱进行系统表征。最终共鉴定了1227个生物碱,其中钩藤657个,毛钩藤361个,大叶钩藤407个,华钩藤410个,无柄果钩藤248个。通过系统比较五种钩藤的生物碱,获取了单个品种的特征生物碱成分群和生物碱的亚型分布特点。4.五种钩藤的区分和市售钩藤的植物基原判别基于植物代谢组学方法对多批次多基原钩藤的化学成分进行系统比较。通过无监督的PCA模型可以看出,除毛钩藤和华钩藤,其他品种之间均能很好地区分,而且种内的差异明显小于种间的差异。此外,以特征生物碱为变量建立支持向量机模型,实现了五种钩藤的区分和鉴别,以及市售钩藤的植物基原分析。结果表明,市售钩藤的主要植物基原为钩藤(U.rhynchophylla)。通过以上研究,本论文1)开发了不稳定氧化吲哚生物碱的制备方法,为中药对照品的制备分离提供了解决方案;2)提出了基于LC-HRMS的靶向生物碱表征策略,为中药复杂体系中目标成分的选择性表征提供了有益参考;3)建立了支持向量机模型,实现了五种钩藤的鉴别和市售钩藤的植物基原分析,为中药的植物基原判别提供了有效手段;4)系统表征和比较了五种钩藤的生物碱成分,阐明了五种钩藤生物碱成分的差异,为进一步研究中药钩藤多基原共用是否合理奠定了基础,为构建科学合理的中药钩藤质量标准提供了科学依据。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284;O657.63


本文编号：2816747