微波超声表面活性剂辅助法联合真菌梯级提取杜仲叶中总黄酮与杜仲胶的工艺研究

发布时间：2020-09-11 17:09

　　杜仲(Eucommia ulmoides Olive.)属于多年生落叶乔木被划分为杜仲科杜仲属,又名扯丝皮、丝联木,是我国特有的经济树种,同时也是国家珍贵的二类保护物种。现代科学研究表明,杜仲叶中含有大量的黄酮成分,还富含白色丝状杜仲胶(Eucommia ulmoides gum,EUG)。黄酮类化合物传统提取溶剂为乙醇或丙酮与水,其存在环境污染的潜在风险,以水为提取溶剂虽然绿色但提取率较低。目前,杜仲胶的提取常以正己烷或石油醚作为主要溶剂,存在有机溶剂消耗量大、成本高、污染环境、安全隐患等问题。并且,还没有出现黄酮和杜仲胶的同时绿色提取的工艺报道,急需进行工艺升级。基于上述原因,本文首先选用对杜仲叶黄酮具有较好增溶性的阴离子表面活性剂为提取溶剂,采用微波超声强化提取叶黄酮,同时表现出对杜仲叶表面角质层较强的去除效果,以利于微生物的培养;在此基础上,以绿色木霉为菌种,对提取总黄酮后的杜仲叶残渣进行发酵培养,代谢其中综纤维素以破坏杜仲叶结构,提高杜仲胶含量与提取溶剂的接触面积,达到提高杜仲胶提取效率和节约溶剂的目的。总结来说,就是首先利用微波超声辅助表面活性剂法提取杜仲叶中的黄酮类化合物,然后利用真菌与溶剂联合作用提取杜仲叶残渣中的杜仲胶,达到一个工艺流程提取总黄酮与杜仲胶的目的,达到一个分步梯级的效果。主要研究内容与结果如下:1、以表面活性剂十二烷基苯磺酸钠胶束为提取介质,采用微波超声辅助法提取杜仲叶中总黄酮及去除杜仲叶表面角质层。以响应面优化杜确定仲叶黄酮的最佳提取工艺为:表面活性剂十二烷基苯磺酸钠浓度为1.5%,提取时间为30 min,提取次数2次,料液比为1:50和微波功率为700 W。在此条件下杜仲叶黄酮的得率为1.45%,提取率达到73.97%,比在相同条件下纯水得率0.36%,提高约为4倍。同时,提取前后杜仲叶表面角质层苏丹Ⅲ染色表明,提取后杜仲叶表面角质层基本去除,有利于后续绿色木霉的发酵培养。2、以提取黄酮和去除表面角质层后杜仲叶残渣为原料,采用绿色木霉液体发酵法代谢其中综纤维素,以提高杜仲胶含量。以正交实验法优化确定绿色木霉最佳发酵条件为:杜仲叶残渣混悬液pH为6,杜仲叶固相物含量9.9%(即固液比1:10),绿色木霉接种量为20%(以悬浮液体积计算,菌种浓度约为5×l06CFU/mL),发酵时间为5 d,绿色木霉的酶活性为19.88 U/mL。在此条件下,杜仲叶残渣失重率为43.81%,杜仲胶的含量由1.7%上升到4.36%。同时,杜仲叶残渣中的纤维素和半纤维素含量分别从原来的25.93%和19.33%,减少为14.81%和8.35%,而木质素含量几乎无变化,这说明绿色木霉主要降解底物为综纤维素。又通过直观观察与SEM扫描电镜再结合综纤维素的前后变化,综合分析可以得出,绿色木霉能有效的破坏杜仲叶的叶片结构。3、以绿色木霉发酵去除综纤维素后的杜仲叶为原料,采用石油醚为溶剂进行杜仲胶提取,与杜仲原叶相比单位质量杜仲胶溶剂消耗量由2.74 mL/g下降为0.70 mL/g,溶剂节省率为74.5%。又以绿色溶剂松节油进行杜仲胶提取,单位质量杜仲胶溶剂消耗量由2.91 mL/g下降为0.96 mL/g,溶剂节省率为67.01%。在此基础上,采用石油醚洗涤杜仲胶,最终纯度为96.6%杜仲胶。通过红外光谱分析核磁共振氢谱分析结果表明,绿色木霉发酵后以松节油提取的杜仲胶结构与传统的一致。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.2
【部分图文】：

技术路线图,杜仲,多糖,咖啡酸

Ｈ２Ｃ0Ｈ邋ｃｈＪｈ邋ｆ逡逑ＯＨ逡逑图１－１３桃叶珊瑚苷逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋１－１３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋Ａｕｃｕｂｉｎ逡逑１．５．３苯丙素类逡逑苯丙素存在于杜仲中各个部位组织中，是木脂素的形成前体，是一类具有一个苯环逡逑与三个直链碳连接结构的天然化合物。根据现有研究显示，十余种苯丙素类物质可被分逡逑离出来，如：咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃ邋Ａｃｉｄ）（图１－１４）、松柏酸（ｌａｒｉｃｉｎｏｌｉｃ邋Ａｃｉｄ）、绿原酸逡逑（ＣｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃＡｃｉｄ）、丁香苷（ｌｉｇｕｓｔｒｉｎ）、松柏音（＜２0１１浪］４１１）等［丨６丨。逡逑Ｈ０逦＾逦ＣＨ＝ＣＨ逦ＣＯＯＨ逡逑ＨＯ＾逡逑图１－１４咖啡酸结构式逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋ｌ－１４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋Ｃａｆｆｅｉｃ邋Ａｃｉｄ逡逑１．５．４其他成分逡逑⑴多糖逡逑杜仲多糖是近年来在杜仲中新发现的活性成分。杜仲叶中大约含有６．２％－１５．３％，逡逑单体表现为白色粉状，易溶于水，但难溶于大部分的有机溶剂［５８１。蔗糖与多糖是在杜仲逡逑药材中主要分离出的两类［５９］，经研宄发现其有很多生理活性作用，降血糖、抗肝纤维逡逑化、提高机体非特异性免疫作用、抗肿瘤和提高机体耐缺氧能力的作用１６０］。这类多糖能逡逑－１３－逡逑

提取装置,杜仲叶,冷凝回流,准确称量

２．２实验方法逡逑准确称量一定量的杜仲叶，将其浸泡在提取溶剂中一定时间，后将杜仲叶与提取溶逡逑剂一起加入微波超声萃取仪中（如图２－１所示），将微波超声反应器与冷凝回流装置连逡逑接好

曲线,总黄酮,曲线,表面活性剂

３逦１逡逑图２－１微波超声提取装置逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋ｍｉｃｒｏｗａｖｅ邋ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｄｅｖｉｃｅ逡逑２．２．２微波超声辅助表面活性剂提取总黄酮的实验设计方案逡逑２．２．２．１表面活性剂的选择逡逑根据黄酮类化合物的性质和叶面角质层的去除的原理为依据，综合考虑表面活性剂逡逑成本与其ｐＨ大小，对总黄酮的提取中选用的表面活性剂做一个筛选。选择使用几种易逡逑溶于水的椰油基葡萄糖苷羟丙基三甲基氯化铵、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基二甲基甜逡逑菜碱、聚乙二醇４００、吐温－８０、十二烷基硫酸钠，以其水溶液ｐＨ值的大小为依据，进逡逑行表面活性剂的筛选。逡逑２．２．２．２单因素优化逡逑根据预实验的结果进行分析，微波超声辅助表面活性剂处理杜仲叶的过程中，应用逡逑的表面活性剂最终被确定，根据超声微波萃取仪的特点其他主要的影响杜仲叶总黄酮得逡逑率的主要影响因素包括表面活性剂的浓度、料液比、时间、微波功率。为验证各因素对逡逑杜仲总黄酮提取率及杜仲叶角质层去除的影响，首先本研宄采用单因素试验进行初步优逡逑化，单因素实验具体操作如下：逡逑考察因素为表面活性剂的浓度：准确称取十二烷基苯磺酸钠

【参考文献】