三黄泻心汤活血化瘀优势方抗动脉粥样硬化作用及机制研究

发布时间：2020-09-11 17:57

　　 研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是多种心脑血管疾病的主要病理基础,严重威胁着人类的生命健康,是发达国家人群的主要死亡原因之一,在我国,尤其是近年来,AS的发病率也呈现逐渐上升的趋势。因而,对于AS发病机制及治疗药物的研究尤显重要,但动脉粥样硬化的致病因素和发病机制极其复杂,且迄今为止,仍未有确切的学说证明其机制。19世纪80年代以来,关于AS发病机制学说众多,主要包括脂质浸润、内皮损伤、平滑肌细胞异常增殖等等。而随着研究的逐渐深入,炎症损伤和氧化应激逐渐成为人们公认的较为重要的发病机制,也是众多学者们研究的重点。关于治疗动脉粥样硬化的药物,目前应用最广泛的为他汀类药物,其对于血脂的调节效果显著,尤其是在降低LDL方面,且有研究表明,他汀类药物除能够有效降低血脂外,还具有抗炎、抗氧化、修复血管和抑制血小板聚集等作用。但随着临床应用的深入,研究发现,他汀类药物具有肝毒性、肌肉损伤、胃肠道反应及神经系统疾病等不良反应。而中药复方作为一种多成分、多靶点的传统药物,能够有效减少机体服药后的不良反应,降低药物耐药性发生率,且与动脉粥样硬化发病机制的多样性相吻合,在治疗AS上,具有一定优势。从中医角度来讲,动脉粥样硬化病因为气血阴阳不足,痰瘀热毒互结,阻滞脉络,临床上的治疗手段多以活血化瘀,化痰解毒为主。三黄泻心汤是临床经典小复方,始载于《金匮要略》,由大黄,黄连和黄芩组成,主要作用为清热解毒,活血化瘀。课题组在前期对于三黄泻心汤炮制配伍九种组分的药效学作用筛选实验中发现,组方7对于血瘀大鼠具有良好的治疗作用,故而本实验以三黄泻心汤活血化瘀优势方(组方7)为受试药物,研究其对AS的治疗作用及其作用机制。研究内容1.三黄泻心汤活血化瘀优势方对大鼠动脉粥样硬化的作用采用高脂饲料喂养联合维生素D3注射及免疫反应激发的方法复制大鼠动脉粥样硬化模型,分为对照、模型、阳性药及三黄泻心汤大、中、小剂量6组。造模8周,给药4周。于12周末,腹主动脉取血,测定以下指标:总胆固醇(Total Cholesterol,T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、超敏 C 反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、白介素 8(interleukin-8,IL-8)、白介素 18(interleukin-18,IL-18)、6-酮-前列腺素 1a(6-keto-prostaglandin F1a,6-keto-PGF!a)、内皮素(Endothelin,ET)、血栓烷素 B2(Thromboxane B2,TXB2)。同时固定其主动脉,HE染色,显微镜下观察血管的病理变化情况。2.三黄泻心汤活血化瘀优势方对HUVECs的保护作用体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umilical vein endothelial cell,HUVECs),MTT法测定三黄泻心汤最大无毒浓度,以200μg· mL-1 Ox-LDL建立细胞损伤模型[],测定细胞存活率;采用放免法测定ET、6-keto-PGF1α、TXB2,分光光度法测定MDA、SOD、NO,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)、人血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的含量。以 60 ng·mL-1 TNF-α 造模,测定细胞存活率,ELISA 检测细胞上清液中的 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1 β、IL-6、IL-8水平,分光光度法测定NO的含量。3.三黄泻心汤活血化瘀优势方抗AS作用机制的研究体外培养HUVECs,以200μg·mL-1 Ox-LDL建立细胞氧化应激损伤模型,ELISA法测定细胞上清液ROS含量,流式细胞仪测定细胞凋亡率及线粒体膜电位变化,Western Blot 法检测凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达情况。以60 ng·mL-1 TNF-α造成细胞炎症损伤模型,Western Blot法检测炎症相关蛋白 VE-Cadherin、E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1 的表达水平。实验结果1.三黄泻心汤活血化瘀优势方对大鼠动脉粥样硬化的作用1)对血脂水平的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够有效降低TC、TG、LDL-C水平、升高HDL-C水平。2)对抗氧化作用的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方对于升高SOD活性,降低MDA活性具有一定的作用。3)对抗炎作用的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够降低Hs-CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎因子的含量。4)对内皮功能的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方对于升高NO、6-keto-PGF1α含量和降低ET、TXB2含量具有显著作用。5)对血管病理形态结构的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够减少脂质沉积及胆固醇结晶,改善钙化程度。2.三黄泻心汤活血化瘀优势方对HUVECs的保护作用1)药物最大无毒浓度及给药量:三黄泻心汤活血化瘀优势方的最大无毒浓度为62.5μg·mL-1。选取62.5、31.25、15.625κg·mL-1三个浓度作为细胞给药浓度。2)对细胞存活率的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够明显提高由Ox-LDL和TNF-α诱导损伤的HUVECs的存活率。3)对细胞分泌活性物质含量的影响:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够显著降低由 Ox-LDL 诱导损伤的 HUVECs 中 MDA、ET、TXB2、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量,升高SOD、NO、6-keto-PGF1α含量。并且明显降低由TNF-α诱导损伤的 HUVECs 中 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1 β、IL-6、IL-8 的含量,升高NO含量。3.三黄泻心汤活血化瘀优势方抗AS作用机制的研究1)抗氧化应激引起的凋亡:三黄泻心汤活血化瘀优势方能够减少ROS的分泌,降低细胞凋亡率,调节凋亡相关蛋白表达(减少Bax、caspase-3、caspase-9表达量并增加Bcl-2的表达量)。2)抗炎作用:三黄泻心汤活血化瘀优势方可有效降低炎症相关蛋白(VE-Cadherin,E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表达量。结论1.三黄泻心汤活血化瘀优势方可从调节血脂、抗氧化、抗炎、改善血管内皮细胞功能等多方面发挥保护AS大鼠的作用。2.三黄泻心汤活血化瘀优势方能够有效保护由Ox-LDL和TNF-α诱导损伤的HUVECs,并且该组方可减少炎症相关蛋白的表达从而抑制炎症发展,亦可通过调节凋亡相关蛋白表达从而抑制由氧化应激引起的内皮细胞凋亡,其保护HUVECs的机制可能与上述作用相关。
【学位单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

３实验结果逡逑３．１药物最大无毒浓度的筛选逡逑对数生长期细胞如图２－１所示，单个细胞生长如多角形或梭形，彼此间的界逡逑限清晰，胞浆丰富，当生长成片后，成典型的铺路石子状。逡逑ｘ２００逡逑图２－１对数生长期ＨＵＶＥＣｓ逡逑如表２－１和图２－２所示，随着三黄泻心汤浓度的增加，对ＨＵＶＥＣｓ的增殖作逡逑用不断增强，并随药物浓度增加呈现增长趋势，当三黄泻心汤浓度达到逡逑ＷｐｇＴｎＬ－１时，出现了明显的抑制，与对照组有显著性差异，因此，三黄泻心汤逡逑作用ＨＵＶＥＣｓ２４ｈ的最大无毒浓度为６２．５ｐｇ．ｍｌＡ选取６２．５０、３１．２５、１５．６３三逡逑个浓度作为细胞给药浓度。逡逑３７逡逑

３实验结果逡逑３．１药物最大无毒浓度的筛选逡逑对数生长期细胞如图２－１所示，单个细胞生长如多角形或梭形，彼此间的界逡逑限清晰，胞浆丰富，当生长成片后，成典型的铺路石子状。逡逑ｘ２００逡逑图２－１对数生长期ＨＵＶＥＣｓ逡逑如表２－１和图２－２所示，随着三黄泻心汤浓度的增加，对ＨＵＶＥＣｓ的增殖作逡逑用不断增强，并随药物浓度增加呈现增长趋势，当三黄泻心汤浓度达到逡逑ＷｐｇＴｎＬ－１时，出现了明显的抑制，与对照组有显著性差异，因此，三黄泻心汤逡逑作用ＨＵＶＥＣｓ２４ｈ的最大无毒浓度为６２．５ｐｇ．ｍｌＡ选取６２．５０、３１．２５、１５．６３三逡逑个浓度作为细胞给药浓度。逡逑３７逡逑

注：＊ＶＳ模型组，ｐ＜０．０１逡逑３．１．２线粒体膜电位检测逡逑如图３－２和图３－３所示，与空白组比较，模型组低膜电位细胞比例明显增大逡逑（／Ｋ０．０１）；与模型组比较，各给药组低膜电位细胞比例明显减小（ｐ＜０．０１）。逡逑Ｊ逦＾邋９逡逑？令益邋ｑｉ

本文编号：2816995