基于铁死亡通路探讨蒿甲醚抗肝纤维化作用及其分子机制

发布时间：2020-09-11 18:48

　　 [背景]肝纤维化是各种慢性肝病过度到肝硬化甚至肝癌的必经之路,因此尽早进行诊断治疗对于防止疾病恶化、提高患者生存率以及改善患者生活质量具有重要意义。目前大量的文献证实肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化发生发展的核心环节。当肝脏受到损伤因子刺激时,静息的HSC会激活转变成活化型HSC,自身不断增殖分泌大量ECM,此外还持续释放多种趋化因子损伤周边的肝细胞、枯否细胞等,进一步加剧肝脏病理状态,所以靶向抑制HSC活化已经成为改善以及治疗肝纤维化的关键策略。发掘靶向抑制HSC活化进而缓解肝纤维化进程的安全高效的药物目前是抗肝纤维化治疗领域的研究热点。本课题致力于抗肝纤维化天然产物药物的研究,发现青蒿素及其衍生物具有良好的改善肝纤维化的疗效。而嵩甲醚(Artemether,ART)作为临床一线抗疟药物,开发其抗肝纤维化这一新的药理活性,将为其相关临床疾病的治疗带来曙光。本研究旨在明确蒿甲醚对肝纤维化的改善作用,并阐明其作用机制。本研究实验结果将为ART作为抗肝纤维化药物提供数据支撑,为ART的作用机制以及潜在靶点提供了崭新的思路和方向。[方法]1.临床样本检测从南京中医药大学附属医院获取28例临床肝脏活检、肝硬化以及肝癌患者肝脏样本,免疫荧光、马松染色以及Real-time PCR考察BRD7分子与肝脏疾病进程的关系。2.体内实验80只雄性ICR小鼠随机分成10组(每组8只):正常对照组、CC14造模组、CC14+空转质粒组、ART低剂量组(5 mg/kg)、ART中剂量组(10 mg/kg)、ART高剂量组(20 mg/kg)、ART(10 mg/kg)+ 空转质粒组、BRD7 shRNA组、ART(10 mg/kg)+BRD7 shRNA组、秋水仙碱组。肝脏宏观检查、苏木精-伊红染色、马松染色、天狼星红染色直观考察小鼠肝脏结构变化,谷草转氨酶、谷丙转氨酶以及碱性磷酸酶试剂盒检测评估小鼠肝损伤情况,羟脯氨酸以及肝纤四项(透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原)试剂盒检测评估小鼠纤维化程度,Real-time PCR、western blot、免疫组化以及免疫荧光考察小鼠肝脏HSC活化(a-SMA、Fibronectin、Collagen 1)和促纤维化(PDGF-βR、EFGR)指标的水平;此外,免疫荧光以及普鲁士蓝染色观察小鼠肝脏铁死亡的发生。3.体外实验选取人源性肝星状细胞LX2、正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2以及SMMC7721作为体外研究对象,MTT和台盼蓝染色考察HSC细胞活力以及死亡情况;免疫荧光、western blot、Real-time实验考察HSC活化指标的表达;台盼蓝染色、PGSK染色、电镜观察、试剂盒检测评估HSC铁死亡的发生;Western blot、免疫共沉淀、免疫荧光检测BRD7的蛋白表达以及P53、BRD7分子的结合情况。[结果]临床肝脏样本的马松、免疫荧光染色以及Real-time PCR结果显示与正常肝组织相比,随着肝脏病程加重,BRD7的表达与a-SMA的表达呈现负相关。体内研究结果显示,ART可以显著改善CC14所致的肝脏病理改变、胶原沉积、HSC细胞的活化以及促纤维化因子的表达。机制研究发现,ART可以选择性地促进活化型HSC细胞表达铁死亡关键指标(SLC2A11、Ptgs2、铁离子)并促使其发生铁死亡,这提示ART对肝纤维化的改善作用与其介导HSC细胞铁死亡密切相关。深入机制探讨发现ART可以增强肝脏BRD7的表达,而BRD7 shRNA可以削弱ART促进HSC铁死亡以及抗肝纤维化作用,这表明BRD7分子极有可能是ART发挥功能的关键分子。体外实验结果显示,ART可以剂量依赖性地降低HSC活化指标蛋白以及基因水平的表达。同时,ART可以诱导HSC呈现出铁死亡的表型:铁离子聚集、脂质过氧化物过载、抗氧化系统失调以及线粒体皱缩,使用铁死亡抑制剂Fer-1反向验证证明ART的确通过介导铁死亡抑制HSC活化。深入机制探讨发现ART可以明显提高BRD7的表达,介导BRD7与P53绑定入核并调控下游铁死亡关键因子SLC 7A11的转录表达,进而调节铁死亡进程。而这一作用则能被BRD7干扰显著削弱,结果表明BRD7-P53-SLC7A11通路介导的铁死亡是ART抗肝纤维化的基础。[结论]本研究体内外实验首先证明ART确实具有抗肝纤维化的疗效,而且这一作用与ART诱导活化型HSC发生铁死亡密切相关。此外,通过软件数据分析以及临床样本、小鼠纤维化肝脏样本和细胞实验观察发现BRD7极有可能与纤维化进程呈现负相关。进一步体内外实验验证ART可以促进BRD7的高表达,而且ART诱导的铁死亡依赖于BRD7介导的P53入核。本实验为ART作为抗肝纤维化药物提供数据支撑,而且为靶向BRD7分子抗纤维化治疗提供研究基础。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图１－３邋Ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ主要调控通路逡逑Ｆｉｇ．１－３邋Ｍａｊｏｒ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｏｆ?

蒿甲醚,抗肝纤维化,动物疾病模型,青蒿素类药物

－４邋Ｔｈｅ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ邋（Ｗｕ邋Ｊ，Ｌｉ邋Ｈ，Ｌｉ邋Ｍ．邋Ｅｆｆｅｃｔｅｔｈｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ａｖｏｖｔｏｓｉｓ，邋ａｎｄ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：邋ｐｏｔｅｎｃａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｐｓｏｒｉａｓｉｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．邋Ｉｎｔ邋Ｊ邋Ｃｌｉｎ邋Ｅｘｖ邋Ｍｅｄ．邋２０１５；邋８（５）：７０６９－７０７８）［４７］逡逑本课题科学问题的提出与内容逡逑我们在前期进行预实验，免疫荧光以及ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验结果揭示蒿甲明显降低活化型ＨＳＣ中ａ－ＳＭＡ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ以及Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋１的表达，显示蒿甲醚确实具有抗肝纤维化的潜能。更有趣的是，青蒿素类药物过氧桥这一特殊结构，被公认为是铁死亡的诱导剂［５２－５３］。但是蒿甲醚调控ＨＳＣ铁死亡发挥抗肝纤维化作用以及具体分子机制的探讨目前未见报道。逡逑为此，本论文采用动物疾病模型以及细胞实验的手段，首先采用体内证蒿甲醚对经典ＣＣ１４致肝纤维化模型具有明显缓解作用以及对活细胞具有显著抑制作用；接着证实蒿甲醚抗肝纤维化的作用确实与

动物实验,方案,蒿甲醚,腹腔注射

逦第二章蒿甲醚体内外显著缓解肝纤维化状况周（Ｆｌｇ．邋２－１）。空白对照组：接受橄榄油腹腔注射；模型组：接受１０％邋ＣＣ１４腹逡逑腔注射８周（每只小鼠０．５ｍｌ／１００ｇ），每周三次【１５］；蒿甲醚低、中、高剂量给药逡逑治疗组：除了接受１０％邋ＣＣ１４腹腔注射８周外，在第５－８周期间同时每天接受低逡逑（５ｍｇ／ｋｇ）、中（１０ｍｇ／ｋｇ）、高（２０ｍｇ／ｋｇ）齐ｌｊ量的蒿甲醚腹腔注射；阳性药秋水逡逑仙碱（０．１邋ｍｇ／ｋｇ）治疗组：除了接受１０％邋ＣＣＵｆ腔注射８周外，在第５－８周期逡逑间同时每天接受秋水仙碱腹腔注射。在末次给药处理后，对所有小鼠进行１天逡逑的禁食不禁水的操作。实验结束后，每只小鼠称重并进行眼眶取血，采血完毕逡逑后剥离完整肝脏以及记录肝脏重量，用于计算肝指数（％）。获取的小鼠血液室逡逑温静置过夜后，离心（２０００邋ｒ／ｍｉｎ，邋２０邋ｍｉｎ）所得的上层血清，－２０°Ｃ冻存，用于逡逑后续血清学指标的检测；分离的肝脏样本，分成若干部分，部分在１０％福尔马逡逑林中性缓冲液固定于室温保存用于后续切片染色实验，部分在－８０°Ｃ或液氮中逡逑快速冷冻保存用于后续的试剂盒、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ以及ＰＣＲ检测。逡逑

【相似文献】