基于液质联用技术的银杏叶提取物药效物质分析及豆腐果苷的体内代谢研究

发布时间：2020-09-11 20:05

　　银杏叶提取物是银杏科植物银杏Ginkgo biloba L的干燥叶,在临床上主要用于治疗瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症等症状。银杏内酯B(GB)是银杏叶中提取物中的一种二萜类化合物,由6个五元环组成,是银杏叶提取物的重要活性成分之一。本研究采用超高效液相-四级杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)技术同时检测和鉴定体内和体外GB的代谢产物,总共检测出53个GB代谢产物。同时本研究建立高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱(HPLC-QTRAP-MS/MS)法同时测定银杏叶提取物中22种成分以及银杏三七山楂茶多酚胶囊中4种皂苷类成分和6种黄酮类成分的含量。为银杏叶提取物以及银杏三七山楂茶多酚胶囊的质量控制提供科学依据。豆腐果苷是从我国云南山龙眼科植物萝卜树H.erratica Hook.f的种子中提取的一种天然芳香酚类糖苷成分,经常用于临床治疗神经衰弱综合征,血管性头痛和三叉神经痛。在本研究中,我们通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析了大鼠体内豆腐果苷潜在的代谢产物,总共鉴定出20个豆腐果苷的代谢物。该实验提供一种简便和准确的方法用于快速检测和鉴定潜在的代谢产物,为进一步研究豆腐果苷的药理学和作用机制提供可靠依据。第一部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的银杏内酯B的体内外代谢研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS方法同时检测和鉴定GB体内外代谢产物。方法:Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1×100 mm,2.7μm),梯度洗脱,A为水相(0.1%甲酸-水),B为有机相(0.1%甲酸-乙腈),洗脱程序为0 min~1min,5%~5%B;1 min~5 min,5%~25%B;5min~15 min,25%~95%B。源温为650oC,柱温为40.0oC,电喷雾电离源(ESI),负离子选择性离子检测方式。SD大鼠分三组,粪便和尿液组6只,血浆组、胆汁组各6只,乙腈萃取,5%乙腈复溶,取上清液进样。MetabolitePilot~(TM) 2.0进行代谢产物分析,并且使用PeakView~?2.2软件和Masterview~?1.1软件对色谱图进行分析。结果:共鉴定出53个代谢产物。包括RLMs中的17个代谢产物、18个血浆代谢产物、26个胆汁代谢产物、30个尿液代谢产物和37个粪便代谢产物。结论:本研究为银杏内酯B潜在代谢产物的检测和鉴定提供一个强大而快速的工具。并且将有助于阐明萜类化合物的活性代谢产物以及潜在的生物学机制。第二部分HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定银杏叶提取物中22种成分的含量目的:建立HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定银杏叶提取物中22种成分的含量。方法:色谱柱:色谱柱为Wonda Cract ODS-2 C18柱(4.6 mm×150mm,5.0μm),流动相为0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D),梯度洗脱。离子源采用负离子检测模式,采用多反应监测模式进行分析。结果:HPLC-QTRAP-MS/MS法测定15批银杏叶提取物中22种成分的峰面积和质量浓度均具有良好的线性关系(r≥0.9985),加样回收率为89.25%~105.9%,精密度、稳定性和重复性RSD值均小于3.94%。结论:本研究为银杏叶提取物中22种成分的含量测定提供一种简便、准确高和灵敏度好的方法。第三部分银杏三七山楂茶多酚胶囊中10种成分的含量测定目的:建立HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定银杏三七山楂茶多酚胶囊中芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、杨梅素、异鼠李素、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1的含量。方法:采用WondaCract ODS-2色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D)为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式(MRM)进行定量分析。结果:HPLC-QTRAP-MS/MS法测定3批银杏三七山楂茶多酚胶囊中10种成分的峰面积和质量浓度在浓度范围内均具有良好的线性关系(r≥0.9985),加样回收率为88.44%~100.7%,精密度RSD值为0.58%~1.82%。结论:该方法灵敏度高、专属性好,可用于银杏三七山楂茶多酚胶囊中黄酮类和皂苷类化学成分的含量测定。第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的豆腐果苷的体内代谢研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法对豆腐果苷在SD大鼠体内代谢产物的研究。方法:Agilent Poroshell 120 EC-C_(18)色谱柱(2.1×100 mm,2.7μm),梯度洗脱,A为有机相(甲醇),B为水相(0.1%甲酸-水),洗脱程序为0 min~1 min 0%~5%B;1 min~10 min 5%~21%B;10 min~15 min21%~45%B;15 min~20 min 45%~95%B。离子源温度为650oC,柱温为40.0oC,电喷雾电离源(ESI),负离子选择性离子检测方式。12只SD大鼠分三组,粪便和尿液组4只,血浆、胆汁组各4只,乙酸乙酯萃取,甲醇复溶,取上清液进样。结果:本实验共检测出代谢产物20个(15个Ⅰ相代谢物,5个Ⅱ相代谢物)。豆腐果苷主要的代谢途径为去甲基化、氧化、脱羟基化、氢化、脱羰基、葡糖苷酸结合和甲基化。结论:该研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术同时检测和鉴定大鼠体内豆腐果苷的代谢产物,为进一步研究豆腐果苷的药理作用提供科学依据。此外,为其他芳香酚类糖苷成分的代谢机制研究提供了实验方法。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

银杏内酯B的化学结构式

基于液质联用技术的银杏叶提取物药效物质分析及豆腐果苷的体内代谢研究

银杏内酯B主要代谢物的结构及其代谢途径Fig.3StructuresandreactionproductsofmainmetabolitesandtheproposedmajormetabolicpathwaysofGB.

基于液质联用技术的银杏叶提取物药效物质分析及豆腐果苷的体内代谢研究

大鼠肝微粒体（A）、粪便（B）、尿液（C）、胆汁（D）、血液（E）中主要代谢物的提取离子流图

【参考文献】